肽核酸调控的荧光发光DNA-Ag纳米簇，用于DNA的灵敏和特异性检测

《Talanta》：Peptide nucleic acid modulated fluorescence light-up DNA-Ag nanoclusters for sensitive and specific detection of DNA

荧光增强型PNA-AgNCs探针的单碱基突变检测机制研究。

　　荧光银纳米簇，特别是DNA模板银纳米簇（DNA-AgNCs），因其可调节的荧光特性和良好的生物相容性而受到广泛关注。近年来，DNA-AgNCs在生物传感、生物成像和肿瘤治疗等领域展现出广阔的应用前景。这种纳米材料不仅具有高量子产率、可调的发射波长和优异的光稳定性，还表现出低毒性和出色的生物兼容性，使其成为一种极具潜力的荧光探针。通过改变寡核苷酸的序列和长度，可以灵活调控DNA-AgNCs的发射光谱，使其适用于多种检测目标。此外，当DNA-AgNCs与不同的增强序列接近时，其荧光强度可以显著增强，呈现出不同的颜色。这些特性使得DNA-AgNCs成为检测金属离子、小分子、蛋白质和核酸等物质的理想工具。

在众多用于构建银纳米簇的模板中，富含胞嘧啶（C-rich）的单链DNA因其结构的灵活性，能够形成高亲和力的胞嘧啶-银离子-胞嘧啶配对，因此被广泛采用。当这些C-rich DNA-AgNCs与富含鸟嘌呤（G-rich）的DNA序列接近时，其荧光强度会显著增强，这一现象为多种核酸检测方法提供了理论基础，尤其是在单核苷酸多态性（SNPs）的检测方面。SNPs是人类疾病研究中的重要组成部分，因此开发高效、特异的检测方法具有重要的科学意义和应用价值。

然而，DNA与DNA-AgNCs之间的相互作用受到多种因素的影响，例如序列特异性、金属离子的存在、热稳定性、DNA的柔韧性以及特殊的DNA结构（如茎环结构、双链结构、G-四联体等）。因此，为了有效调控DNA-AgNCs的光学特性，必须对与之相互作用的DNA序列或其周围环境的变化进行严格管理。基于此，迫切需要开发一种稳健、非序列特异性和环境不敏感的探针，以实现对DNA-AgNCs荧光特性的有效调控。

肽核酸（PNA）作为一种重要的核酸探针材料，其结构与DNA类似，但具有不同的化学特性。PNA的磷酸二酯骨架被替换为结构类似但电中性的N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架，这一特性赋予了PNA优越的杂交能力和对酶降解的高抗性。PNA在分子诊断和基因治疗等众多领域展现出巨大的应用潜力。由于其独特的电中性和刚性骨架结构，PNA在与DNA相互作用时表现出更高的稳定性和结合亲和力，使其成为DNA的重要补充材料。

尽管PNA在生物医学领域具有广泛的应用前景，但目前关于PNA与AgNCs之间相互作用的研究仍相对有限。因此，探索PNA与AgNCs之间的相互作用机制，对于开发基于PNA-AgNCs的新型纳米设备和生物检测方法具有重要意义。本研究首次发现，含有混合碱基的硫醇修饰PNA（SH-PNA）探针可以通过共价和非共价相互作用显著增强C12-AgNCs的荧光发射强度。这一增强机制与序列特异性无关，表明SH-PNA具有广泛的适用性。

为了进一步阐明PNA与DNA-AgNCs之间的相互作用机制，我们系统地研究了PNA浓度、序列组成和链长等因素对AgNCs荧光发射特性的影响。同时，我们还比较了PNA、其与DNA形成的复合物（PNA-DNA）及其DNA类似物对AgNCs荧光发射性能的调控作用。通过这些研究，我们发现PNA不仅能够增强AgNCs的荧光强度，还能显著改善其检测灵敏度和特异性。

基于上述发现，我们开发了一种适用于检测单碱基突变的多功能传感平台。该平台利用PNA-AgNCs的荧光增强机制，能够在无需探针标记或酶辅助信号放大的情况下，实现对DNA的高灵敏度和高选择性检测。此外，该平台适用于任何序列背景下的DNA检测，为基因突变的快速筛查提供了新的思路和技术手段。

在实验过程中，我们使用了多种材料和试剂，包括不同的寡核苷酸、PNA单体、Rink Amid MBHA树脂等。所有寡核苷酸均由上海桑根生物科技有限公司合成并经过高效液相色谱（HPLC）纯化。PNA单体则从韩国PANAGENE公司购买。PNA探针的合成采用了Fmoc固相肽合成方法，在MBHA树脂上进行合成，并使用HBTU作为酰胺形成试剂。硫醇修饰的PNA（SH-PNA）探针的制备过程也遵循了相应的化学合成步骤。

本研究的创新点在于首次发现混合碱基的SH-PNA探针能够显著增强C12-AgNCs的荧光强度，这一现象与序列特异性无关。此外，我们还发现，通过调控PNA的浓度、序列组成和链长，可以有效地控制AgNCs的荧光发射特性。这些发现不仅拓展了PNA在生物传感领域的应用范围，还为开发基于PNA-AgNCs的新型检测方法提供了理论依据和技术支持。

在实际应用中，我们成功地将这一检测策略应用于NCI-H661肺癌细胞中TP53基因片段的单碱基错配检测。实验结果表明，该方法能够在45分钟内快速筛选出突变基因，并且具有较高的检测灵敏度和特异性。检测限达到1.3 nM，表明该方法能够有效检测低浓度的DNA目标。此外，该方法的操作流程简单，不需要复杂的仪器设备，因此在实际应用中具有显著的优势。

本研究的成果不仅为DNA-AgNCs的荧光增强机制提供了新的理解，也为开发基于PNA-AgNCs的新型生物检测系统奠定了基础。通过简单地修改PNA探针的序列，这一检测策略可以灵活地应用于其他核酸的检测，例如RNA或DNA的其他突变形式。这为未来的生物医学研究和临床检测提供了新的可能性和方向。

总的来说，本研究通过系统地探索PNA与DNA-AgNCs之间的相互作用机制，发现混合碱基的SH-PNA探针能够显著增强C12-AgNCs的荧光强度，并且这种增强机制不依赖于序列特异性。基于这一发现，我们开发了一种高效、特异的DNA检测平台，能够快速、准确地识别单碱基突变。该方法具有操作简便、检测灵敏度高、无需复杂仪器等优点，为基因突变的检测提供了新的解决方案。此外，该方法的广泛适用性也为其在其他生物医学领域的应用拓展了可能性，具有重要的理论和实践意义。