突尼斯大蒜中大蒜病毒D（GarV-D）的首次检测报告及其分子特征分析

《Journal of Plant Pathology》：First report of garlic virus D on garlic (Allium sativum) in Tunisia

本研究针对突尼斯大蒜病毒种类不清的问题，开展了大蒜病毒D（GarV-D）的首次检测研究。通过对66份大蒜种质资源进行RT-PCR检测，发现85%样品感染GarV-D，经序列分析证实其与国内外分离株存在88-98%的核苷酸同源性。该研究填补了突尼斯GarV-D流行数据的空白，为大蒜病毒病防控提供科学依据。

　　

大蒜作为全球重要的蔬菜作物，不仅具有丰富的营养价值，还因其独特的药用价值受到广泛关注。然而，大蒜在生产过程中极易受到多种病毒的侵染，其中由Allexivirus属病毒引起的病毒病尤为突出。这类病毒包括8个明确分类的物种，构成感染大蒜的最大病毒群组，严重影响大蒜的产量和品质。在突尼斯，虽然此前已有大蒜病毒A（GarV-A）、大蒜病毒B（GarV-B）和大蒜病毒C（GarV-C）的报道，但大蒜病毒D（Garlic virus D, GarV-D）的存在情况尚属未知领域。

为了解决这一知识空白，由Chadha Ayed领衔的研究团队开展了针对性的调查研究。该研究聚焦于突尼斯国家基因库保存的66份大蒜种质资源，通过对表现出轻微叶片褪绿、畸形和鳞茎变小等症状的样品进行系统分析，首次在突尼斯境内确认了GarV-D的存在。这项重要研究成果发表在植物病理学领域的权威期刊《Journal of Plant Pathology》上，为理解大蒜病毒病的流行规律和防控策略提供了关键数据。

研究人员采用Foissac等人描述的硅基法提取总RNA，通过针对外壳蛋白（CP）基因设计的特异性引物进行RT-PCR检测，成功扩增出531 nt的片段。令人惊讶的是，在66份样品中，有56份（85%）检测结果为阳性，表明GarV-D在突尼斯大蒜种群中具有极高的流行率。为了确保结果的可靠性，研究团队还对四个阳性样本的扩增产物进行了测序分析，发现这些突尼斯分离株之间的核苷酸同源性为90-97%，与阿根廷已知分离株"Mesi 13"的同源性达到88-98%。

由于缺乏GarV-D的特异性抗血清，研究人员采用了一种替代策略进行验证。他们使用另一对引物，靶向覆盖部分CP和核酸结合蛋白（NABP）基因的455 bp区域，对四个已测序样本进行再次检测。测序结果显示，这些样本之间的核苷酸同源性为86-94%，与中国、捷克共和国和印度的GarV-D分离株的同源性达到94.5-96.5%。这一多重验证方法确保了检测结果的准确性，也为后续研究提供了可靠的技术路线。

材料与方法

研究选取突尼斯国家基因库保存的66份大蒜种质资源作为实验材料。技术方法主要包括：使用硅基法提取总RNA；设计特异性引物进行RT-PCR检测，分别靶向CP基因（531 nt）以及CP-NABP基因区域（455 bp）；对扩增产物进行测序和序列比对分析。

结果

GarV-D的高发生率：通过对66份大蒜样品的RT-PCR检测，发现56份（85%）呈现GarV-D阳性反应，表明该病毒在突尼斯大蒜种群中具有广泛分布。

分子特征分析：四个阳性样本（MN995832、MN995833、MK829785、MK829786）的测序结果显示，突尼斯GarV-D分离株之间存在90-97%的核苷酸序列同源性，与阿根廷分离株KR819505的同源性为88-98%。

验证实验：使用替代引物对CP-NABP基因区域进行扩增和测序（PV744313-PV744316），结果显示与中国（KX889790）、捷克（JX682878）和印度（KR045605）分离株的核苷酸同源性分别为94.5-96.5%，进一步证实了GarV-D的身份。

这项研究首次证实了GarV-D在突尼斯大蒜中的存在，揭示了该病毒在当地的高流行率。研究结果不仅完善了对突尼斯大蒜病毒种群组成的认识，也为制定有效的病毒防控策略提供了重要依据。高感染率的存在提示GarV-D可能是导致突尼斯大蒜产量和质量下降的重要因素之一，这一发现对于保障大蒜产业健康发展具有重要意义。

研究的创新之处在于采用了多重分子验证策略，克服了缺乏特异性抗血清的技术限制。通过系统发育分析，揭示了突尼斯GarV-D分离株与国际已知分离株的遗传关系，为理解该病毒的全球分布和进化历史提供了新的视角。未来研究需要进一步探讨GarV-D与其他大蒜病毒的互作关系，以及其对大蒜产量和品质的具体影响机制，为综合防控方案的制定提供更全面的科学支撑。