综述：近期在用于研究人类单胺氧化酶的荧光底物开发方面取得了进展：底物设计基于代谢反应类型进行优化

《Materials Today Chemistry》：Recent advances in the development of fluorescent substrates for investigating human monoamine oxidase: Substrate design driven by metabolic reaction types

hMAO酶活性检测荧光底物设计策略及临床应用进展。

　　人类单胺氧化酶（hMAOs）在多种疾病的形成和发展过程中扮演着关键角色。hMAOs主要包括两种同工酶：hMAO-A和hMAO-B。这两种酶虽然在序列上具有约70%的同源性，但它们在细胞和组织中的分布、对不同底物的选择性以及功能方面存在显著差异。hMAO-A主要负责代谢5-羟基色胺、去甲肾上腺素和肾上腺素等物质，而hMAO-B则更倾向于代谢苯乙胺和苯甲胺。这种不同的底物偏好使得它们在神经递质代谢、神经退行性疾病以及癌症免疫治疗等领域具有独特的作用。因此，监测hMAOs的活性和表达水平对于深入理解其生理功能以及相关疾病的临床诊断具有重要意义。

荧光底物检测法是一种有效的hMAOs活性检测手段，其优势在于能够在体内进行实时成像、非侵入性检测以及高灵敏度和高分辨率。然而，设计能够特异性识别hMAOs的荧光底物仍面临诸多挑战。为了克服这些困难，本综述系统地探讨了基于hMAOs蛋白结构、活性位点和催化机制的六种荧光底物的设计策略。同时，详细阐述了hMAOs与荧光底物之间的识别和反应机制，以及这些底物在复杂生物基质中检测hMAOs活性的应用潜力。此外，还分析了hMAOs荧光底物开发中存在的问题和未来的发展方向，为更高效地设计和开发hMAOs荧光底物提供了重要的理论支持和参考依据。

hMAO-A的活性位点是一个疏水性的单一腔室，其尺寸约为550 ?。相比之下，hMAO-B的活性位点具有平坦且延长的双腔结构，由入口腔室（约290 ?）和底物腔室（约420 ?）组成。这两个腔室之间通过一个由异亮氨酸199形成的“门”结构进行分隔，这种结构能够限制酶构象变化。hMAO-A在膜结合状态下是单体，但在某些情况下会形成二聚体，而hMAO-B则天然为二聚体。活性位点的结构特征决定了其对底物和抑制剂的识别能力，例如，hMAO-A的芳香笼区域由酪氨酸残基组成，能够增强底物结合的亲核性，而hMAO-B的类似结构则对底物的识别方式有所不同。

在不同组织中，hMAOs的表达水平存在显著差异。例如，在人类神经组织和胃肠道组织中，hMAOs的表达水平较高，而在肝脏、肾脏等其他组织中则相对较低。hMAO-A主要分布在去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元中，而hMAO-B则主要分布在血清素能和组胺能神经元以及胶质细胞中。在周围组织中，hMAO-A在胎盘、成纤维细胞、肝脏、肠道和甲状腺中都有分布，而hMAO-B则主要存在于血小板、肝脏、胰岛和肾脏中。了解hMAOs在不同组织中的分布模式对于开发能够特异性靶向某些组织的荧光底物至关重要。此外，hMAOs的表达水平随着年龄增长而增加，且在心脏细胞和神经组织中，MAO-A和MAO-B的表达水平与年龄呈正相关。这一现象为研究hMAOs在衰老和神经退行性疾病中的作用提供了理论基础。

hMAOs的催化机制涉及底物与酶活性位点的相互作用。以苯乙胺为例，hMAOs首先通过芳香残基与底物的正电荷部分相互作用，引导其进入底物结合位点。随后，底物对黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子进行亲核攻击，导致其质子化。接着，底物的氨基碳原子附近的碳-氢键断裂，释放出一个氢化物等价物，使FAD转化为FADH2。之后，底物转化为不稳定的亚胺离子中间体，最终通过水解反应生成苯乙醛。这一催化过程不仅有助于理解hMAOs的反应机制，也为设计能够模拟这一过程的荧光底物提供了理论依据。

为了实现对hMAOs的荧光检测，科学家们开发了多种类型的荧光底物。其中，第一类底物（Type I）利用荧光染料与hMAOs的识别模式结合，通过氧化和β-消除反应生成荧光产物。这类底物在实验室环境中可以检测hMAOs的活性，但由于其发射波长的限制，难以用于体内和体外成像。为了解决这一问题，研究团队开发了专门针对hMAO-A的荧光底物，如探针3，它使用邻苯二酚作为荧光染料，并通过特定的修饰提高了对hMAO-A和hMAO-B的区分能力。探针3表现出较高的灵敏度，检测限低至2.7 μg/mL，并且在神经母细胞瘤细胞和肝癌细胞中显示出良好的荧光响应特性。

第二类底物（Type II）则依赖于hMAOs对底物氨基部分的氧化反应，生成亚胺离子，随后发生水解反应形成醛类中间体，再通过自环化反应产生荧光产物。这类底物在体内成像方面具有优势，例如探针7，它通过两光子成像技术实现了对hMAO-B的特异性检测，并且能够用于区分肝纤维化小鼠与正常小鼠。探针7的结构设计使其在细胞内能够有效识别hMAO-B，并在活体成像中展现出良好的应用前景。

第三类底物（Type III）以甲基四氢吡啶作为报告基团，其反应机制涉及底物在hMAOs活性位点中的氧化，形成二氢吡啶盐，从而触发荧光信号。这类底物在检测hMAO-B时表现出较高的灵敏度和选择性，但其发射波长较短，限制了其在活体成像中的应用。为了解决这一问题，研究团队设计了探针13，它使用四苯基乙烯（TPE）作为AIE荧光基团，能够有效避免荧光淬灭现象，并在体内成像中展现出良好的性能。

第四类底物（Type IV）则结合了荧光染料和特定的靶向分子，利用分子内部的受限旋转来触发荧光释放。这类底物在检测hMAO-B时表现出较高的灵敏度，例如探针15，它能够用于检测B淋巴细胞中的hMAO-B活性，并且在活体成像中显示出良好的应用潜力。探针16则利用他克莫司作为荧光染料，并结合靶向基团，能够用于研究hMAO-B与衰老过程的关系。

第五类底物（Type V）基于hMAO-A的催化反应，其荧光激活机制涉及底物与FAD的共价结合，从而产生强烈的荧光信号。探针17是一种新型的荧光抑制剂，能够通过共价标记hMAO-A，实现对其活性的实时检测。探针17在检测hMAO-A时表现出较高的灵敏度和特异性，检测限低至1.4 nM，并且能够快速响应，仅需20秒即可完成检测。此外，探针17的两光子特性使其能够用于区分人胶质瘤组织和周围组织中的hMAO-A表达水平。

第六类底物（Type VI）则利用分子内部的受限旋转来触发荧光释放。这类底物在检测hMAO-A和hMAO-B时表现出良好的选择性和灵敏度，例如探针18，它能够通过两光子成像技术快速检测hMAO-A的活性，并且在临床样本中显示出较高的应用价值。探针18的结构设计使其能够在体内环境中保持稳定的荧光信号，同时减少背景干扰，为研究hMAOs在疾病中的作用提供了有力工具。

尽管现有的hMAOs荧光底物在检测性能和应用范围上取得了显著进展，但仍存在一些挑战。例如，大多数荧光底物对hMAO-A表现出更高的选择性，而对hMAO-B的检测能力相对不足。此外，现有的荧光底物主要依赖于荧光成像技术，而生物发光和化学发光底物的应用较少，这可能限制了其在深部组织成像中的潜力。为了进一步提高hMAOs荧光底物的性能，研究者需要开发更多样化的底物类型，并探索不同的荧光机制。同时，结合计算机辅助设计，通过建模和模拟优化底物结构，提高其在复杂生物环境中检测hMAOs活性的准确性和效率。

未来的研究方向包括开发更多针对hMAO-B的荧光底物，以弥补当前对hMAO-A的过度关注。此外，探索基于生物发光和化学发光的底物设计，将有助于在深部组织成像中减少背景干扰。同时，设计能够特异性靶向不同组织的荧光底物，将有助于在疾病早期诊断和手术引导中发挥重要作用。随着技术的不断进步，hMAOs荧光底物的开发将为神经递质代谢研究、疾病诊断和治疗提供新的思路和方法。通过不断优化底物的结构和性能，有望实现对hMAOs活性的高效、精准检测，从而推动相关领域的深入研究和应用发展。