绘制细胞内HMGB1相互作用网络以及Toll样受体4激活所引起的变化

《Journal of Bodywork and Movement Therapies》：Mapping the intracellular HMGB1 interactome and alterations induced by Toll-like receptor 4 activation

HMGB1通过调控细胞迁移和肌动蛋白聚合参与应激反应，BioID互作组学鉴定了静息/应激状态下8个差异蛋白并验证其相互作用，揭示了HMGB1在核受体通路、G蛋白信号和线粒体功能中的新角色。

　　HMGB1，即高迁移率族蛋白1，是一种在进化过程中高度保守的蛋白质，广泛参与多种生物学功能。它不仅在染色质结构调控、DNA转录调控以及DNA修复过程中发挥关键作用，还参与细胞应激反应和免疫反应。这种多功能性使得HMGB1成为许多疾病治疗的重要靶点，如类风湿性关节炎、癌症和败血症等。尽管已有大量研究探讨了HMGB1在细胞外和细胞内的作用，但其在细胞内维持正常状态时的功能仍不完全清楚。为了更好地理解HMGB1在细胞内调控的机制，本研究通过使用基于BioID的邻近蛋白质组学技术，系统分析了静止和LPS（脂多糖）应激状态下的单核细胞THP-1细胞中HMGB1的相互作用蛋白。

通过该技术，我们鉴定出超过100种蛋白质作为HMGB1的相互作用蛋白，其中大部分此前未被报道。在静止和LPS应激状态下，有八种蛋白质显示出显著的丰度差异，包括CACTIN、EIF4G3、GNA12、HSPB1、KOW结构域包含蛋白、MTHFD11、TADA2B和TPD52L2。这些结果表明，HMGB1在细胞内具有广泛的相互作用网络，并且其功能在细胞应激条件下发生了显著变化。为了进一步验证这些相互作用，我们选择了部分HMGB1的相互作用蛋白进行计算建模，并通过邻近连接实验（PLA）在体外进行了确认。

实验结果显示，某些HMGB1的相互作用蛋白与细胞迁移密切相关。通过HMGB1基因敲除和shRNA介导的敲低实验，我们发现HMGB1缺失会导致细胞迁移能力增强，同时细胞体积增大和肌动蛋白聚合失调。这些结果表明，HMGB1不仅在细胞应激中发挥重要作用，也在维持细胞内平衡中具有关键功能。综上所述，本研究首次系统鉴定了HMGB1的细胞内相互作用网络，并揭示了其在正常和应激状态下不同的分子机制。这为未来关于HMGB1功能的研究提供了重要的基础，尤其是在细胞内稳态维持和细胞应激反应方面的探索。

在细胞内，HMGB1的分布和功能受到多种因素的影响。通过SILAC（稳定同位素标记氨基酸）技术，我们对THP-1细胞进行了标记，并在BioID实验中对相互作用蛋白进行了定量分析。结果显示，HMGB1在细胞内主要存在于细胞核、细胞质和线粒体中，并且其相互作用网络涵盖了多种生物学过程，包括DNA转录调控、信号传导和线粒体功能。通过Reactome富集分析，我们发现HMGB1主要参与“核受体转录途径”和“线粒体蛋白输入”等过程。此外，LPS应激导致HMGB1与一些蛋白质的相互作用显著增加，如GNA12、HSPB1和NIFK等，这些结果表明HMGB1在细胞应激条件下的功能发生了重要变化。

计算建模进一步揭示了HMGB1与某些蛋白质的直接相互作用。我们使用高通量软件InterEvDock3对HMGB1的相互作用蛋白进行了虚拟对接，并根据对接结果确定了蛋白质相互作用的位点。这些建模结果表明，HMGB1可能通过不同的结构域与多种蛋白质结合，如A-box区域、B-box区域和酸性C-尾区域。通过PLA实验，我们验证了这些相互作用的生物学意义，发现HMGB1与CAT、DVL2、GNA12、HCLS1、HSPB1、NIFK和S100A6等蛋白存在相互作用，这些结果进一步支持了HMGB1在细胞内调控多种生物学过程的假设。

在细胞迁移和肌动蛋白聚合方面，我们发现HMGB1的缺失会导致细胞迁移能力增强，细胞体积增大以及肌动蛋白聚合紊乱。通过HMGB1基因敲除的鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和THP-1细胞实验，我们验证了这些结果。这些发现不仅揭示了HMGB1在细胞迁移中的重要作用，还表明其在维持细胞结构和运动能力中的关键作用。此外，我们还发现HMGB1与一些蛋白质，如HCLS1和ARPC3，共同参与肌动蛋白聚合，这些结果进一步支持了HMGB1在细胞迁移和运动中的调控作用。

本研究的方法学具有一定的局限性。所有实验均在细胞系中进行，未在原代细胞中验证。此外，由于BioID2与HMGB1的融合结构比内源性HMGB1大，可能影响其生物学功能。通过裂解液分馏和免疫细胞化学实验，我们检测到一些小分子量的核蛋白可能泄漏到细胞质中，从而影响了实验结果的准确性。尽管如此，我们仍成功鉴定出116种HMGB1的相互作用蛋白，并通过计算建模和PLA实验验证了其中七种新型相互作用蛋白的结合位点。

此外，我们还对HMGB1的相互作用蛋白进行了信号通路分析，发现它们可能参与Wnt信号通路和Rho GTPase信号通路。这些通路在细胞应激条件下发生了显著变化，表明HMGB1在细胞应激中的调控作用可能涉及更广泛的信号传导机制。我们还发现，HMGB1与一些蛋白质如GNA12和HCLS1的相互作用可能影响细胞迁移和运动能力。这些结果不仅扩展了我们对HMGB1功能的理解，还为未来研究提供了新的方向。

本研究的发现表明，HMGB1不仅在细胞应激中发挥作用，也在维持细胞内平衡中具有重要地位。通过系统分析HMGB1的相互作用网络，我们揭示了其在细胞核、细胞质和线粒体中的作用，并发现了一些与细胞迁移和肌动蛋白聚合相关的蛋白质。这些结果为未来研究HMGB1在细胞应激和细胞内稳态中的功能提供了重要的基础。同时，我们也为未来开发针对HMGB1的药物提供了潜在的靶点，尤其是在细胞迁移和运动能力调控方面。

总之，本研究首次系统鉴定了HMGB1的细胞内相互作用网络，并揭示了其在正常和应激条件下的不同分子机制。这些结果不仅拓展了我们对HMGB1功能的认识，还为未来研究提供了重要的数据支持。通过计算建模和PLA实验，我们验证了多个新的HMGB1-蛋白相互作用，并揭示了其在细胞内调控多种生物学过程的潜力。这些发现为未来研究HMGB1在细胞应激和细胞内稳态中的作用提供了新的方向，同时也为开发新的治疗策略提供了理论依据。