生长素诱导的人类CCR4-NOT亚基缺失揭示了CNOT1和CNOT4在mRNA代谢中的相反功能

《Journal of Bodywork and Movement Therapies》：Auxin-Induced Depletion of Human CCR4-NOT Subunits Reveals Opposing Functions of CNOT1 and CNOT4 in mRNA Metabolism

通过快速诱导降解系统研究CCR4-NOT复合体亚单位CNOT1和CNOT4的功能，发现CNOT1耗竭导致复合体解体和mRNA整体稳定，而CNOT4耗竭虽不破坏复合体却加速mRNA周转，且效应与密码子最优性相关。BioID验证CNOT4与复合体在活细胞中相互作用，但未共纯化。研究揭示了CNOT1和CNOT4在mRNA代谢中的相反作用机制。

　　CCR4-NOT是调控基因表达多个阶段的重要复合体，包括转录、mRNA降解、蛋白质泛素化和翻译。尽管该复合体最初在酵母中被发现，但在真核生物中高度保守，其组成和功能在哺乳动物与酵母之间存在差异。例如，与酵母Not4不同，人类CNOT4（E3泛素连接酶）并不与CCR4-NOT形成稳定的复合体，其功能也比酵母的对应物更加不明确。为了探讨CNOT1（核心支架亚基）和CNOT4的作用，我们开发了一种快速的生长素诱导降解（AID）细胞培养系统，以实现对这些关键蛋白的急性耗竭。我们研究了它们缺失对复合体完整性、细胞生长和mRNA表达及降解的影响。我们的转录组分析显示，耗竭CNOT1会改变数千个转录本的表达，其中大多数转录本的丰度增加，而mRNA降解整体减少。虽然CNOT4通过标准生化方法无法与复合体共纯化，但通过BioID邻近标记实验确认其在细胞中与复合体存在关联。然而，耗竭CNOT4并未影响CCR4-NOT的完整性，反而导致mRNA降解加速。最后，我们发现CCR4-NOT耗竭细胞中mRNA稳定性变化与转录本的密码子最优性有关。我们的数据表明，CNOT4在mRNA代谢中与CNOT1的作用相反，并且CNOT4可能具有与促进mRNA降解的复合体亚基不同的功能。

为了更深入理解这些作用，我们建立了AID策略，通过快速耗竭CNOT1和CNOT4来研究它们对CCR4-NOT复合体功能的影响。我们发现，与之前的研究一致，CNOT1的耗竭会导致复合体解体，并且mRNA整体稳定性增加。相比之下，CNOT4的耗竭对细胞生长没有明显影响，但长期的生长素处理会减缓细胞生长。流式细胞术显示，CNOT1的耗竭导致细胞在G1/S期显著增加，而CNOT4的耗竭则没有观察到细胞周期停滞。这些结果表明，实验应在24小时内进行。

进一步分析了CNOT1和CNOT4的耗竭对CCR4-NOT复合体组成和完整性的影响。我们使用尺寸排除色谱（SEC）分析了处理后的细胞裂解物，发现CNOT1的耗竭导致复合体解体，而CNOT4的耗竭不影响复合体完整性。这表明，CNOT1的耗竭导致了复合体的解体，从而减少了多个亚基的蛋白水平。CNOT4虽然与复合体存在相互作用，但其耗竭并未影响复合体结构，反而导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4不与复合体形成稳定结构，但其在细胞内的存在可能对mRNA的代谢有重要影响。

通过BioID邻近标记实验，我们进一步确认了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体及mRNA调控因子存在关联。虽然CNOT4无法通过标准方法与复合体共纯化，但其在细胞内与复合体存在密切联系。我们发现，CNOT4与CNOT1的相互作用在细胞内显著，而通过标准方法无法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体的亚基相互作用来影响mRNA代谢。我们的数据进一步支持了之前的研究，即CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系，尽管其与复合体的结合较弱，可能无法在生化实验中检测到。

我们进一步研究了CNOT1和CNOT4的耗竭对稳态mRNA水平的影响。结果表明，CNOT1的耗竭主要导致mRNA丰度增加，而CNOT4的耗竭对mRNA稳态水平的影响相对较小。这可能与CNOT1和CNOT4对复合体完整性的不同影响有关。CNOT1的耗竭破坏了复合体，导致其功能丧失，而CNOT4的耗竭未影响复合体完整性，反而可能促进了mRNA的降解。此外，我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA的稳定性变化与CNOT1的耗竭存在显著差异，这表明两者在mRNA代谢中的作用方向相反。

通过比较CNOT1的耗竭与siRNA敲低研究的结果，我们发现两者在mRNA稳定性变化上存在高度显著的正相关。这表明，CNOT1的耗竭对mRNA的影响具有普遍性，而CNOT4的耗竭则表现出不同的作用机制。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

在实验方法上，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论。

通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过比较CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论。

通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论。

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通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

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通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

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通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论。

通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论。

通过分析CNOT1和CNOT4的耗竭对mRNA稳定性的影响，我们发现两者在mRNA代谢中的作用方向相反。CNOT1的耗竭导致mRNA整体稳定性增加，而CNOT4的耗竭则导致mRNA降解加速。这表明，尽管CNOT4是E3泛素连接酶，但其在mRNA降解中的作用可能与CNOT1不同。我们还发现，CNOT4的耗竭对mRNA稳定性变化与密码子最优性有关，但与CNOT1的作用方向相反。这表明，尽管两者都与mRNA稳定性相关，但CNOT4可能在不同的条件下发挥不同的功能。

通过实验方法，我们使用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，将AID标签引入CNOT1和CNOT4的C端，以实现对这些蛋白的快速耗竭。我们还进行了细胞裂解和Western blot分析，确认了AID标签对细胞功能和蛋白表达的无影响。此外，我们还进行了细胞活力实验，包括台盼蓝排除法和MTT法，以评估CNOT1和CNOT4的耗竭对细胞生长的影响。我们的实验结果显示，CNOT1的耗竭显著抑制了细胞生长，并导致细胞周期停滞，而CNOT4的耗竭则没有观察到这些效应。

通过邻近标记实验，我们进一步分析了CNOT1和CNOT4在细胞内的相互作用。我们发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在细胞内显著，但无法通过标准方法检测到。这表明，CNOT4可能通过与复合体亚基的相互作用来影响mRNA代谢。我们还发现，CNOT1和CNOT4的相互作用在不同细胞系中均存在，这表明它们的相互作用具有普遍性。这些结果支持了CNOT4在细胞内与CCR4-NOT复合体存在密切联系的结论