circTGFBR2(3-6) 作为 RNA 结合蛋白 IGF2BP3 和 TGFBR1 mRNA 的组装平台，从而增强乳腺癌细胞的可塑性

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：circTGFBR2(3-6) acts as an assembly platform for RNA-binding protein IGF2BP3 and TGFBR1 mRNA to enhance breast cancer cell plasticity

本研究发现，环状RNA circTGFBR2(3-6)通过增强IGF2BP3与TGFBR1 mRNA的相互作用，促进TGF-β/SMAD信号传导，从而促进乳腺癌细胞的表型转换、迁移、外渗和化疗抵抗。机制涉及m6A依赖的RNA结合蛋白IGF2BP3调控TGFBR1 mRNA稳定性，并通过CRISPR/Cas9和shRNA验证了其关键作用。

　　TGF-β信号通路是诱导上皮-间质转化（EMT）的关键驱动因素，这一过程在癌症细胞的可塑性和转移潜能中起着重要作用。然而，环状RNA（circRNA）在TGF-β信号通路中的作用仍然知之甚少。在这项研究中，我们鉴定出一种源自TGF-β受体2（TGFBR2）前mRNA的circRNA，即circTGFBR2(3-6)，并发现其是乳腺癌细胞中TGF-β/SMAD信号通路的重要增强因子。circTGFBR2(3-6)的表达被抑制后，会显著降低TGF-β诱导的EMT、细胞迁移以及乳腺癌细胞在体内的外渗能力。从机制上讲，circTGFBR2(3-6)作为支架，促进RNA结合蛋白胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3（IGF2BP3）与TGFBR1mRNA之间的相互作用，这种相互作用依赖于N6-甲基腺苷（m6A）修饰，从而稳定TGFBR1mRNA并促进其表达。此外，IGF2BP3的敲除会削弱circTGFBR2(3-6)介导的TGF-β/SMAD信号通路增强作用，以及TGF-β诱导的EMT和细胞迁移。我们的研究结果表明，circTGFBR2(3-6)是TGF-β/SMAD信号通路在受体层面的新型增强因子，并强调IGF2BP3作为关键的m6A读取蛋白，介导circTGFBR2(3-6)驱动的乳腺癌细胞可塑性。

EMT赋予上皮癌细胞在转移过程中所需的可塑性，使得它们能够脱离原发肿瘤并在其他器官形成转移灶。EMT的一个显著特征是上皮标志物如E-钙粘蛋白的下调，以及间质标志物如N-钙粘蛋白、纤连蛋白和波形蛋白的上调。大多数癌细胞经历的是混合或部分EMT，这不仅增加了其侵袭性，还赋予了类似干细胞的特性，使其对化疗具有耐药性。TGF-β信号通路在诱导EMT和推动癌症进展中起着至关重要的作用，其通过与TGFBR1和TGFBR2受体结合，进而激活SMAD2和SMAD3（SMAD2/3）在两个羧基末端丝氨酸残基上的磷酸化。激活的SMAD2/3与SMAD4形成的复合物进入细胞核，诱导目标基因如SERPINE1（编码纤溶酶原激活物抑制剂1，PAI-1）、CCN2（编码细胞外基质生长因子，CTGF）和SNAI1（编码SNAIL转录抑制因子1，SNAI1）的转录，从而调控EMT相关细胞过程。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核mRNA上最丰富的内部修饰，其在转录后基因调控中发挥着关键作用。m6A的安装由甲基转移酶（“writers”）完成，如甲基转移酶样蛋白3（METTL3）和METTL14，而其去除则由去甲基酶（“erasers”）如脂肪质量与肥胖相关蛋白（FTO）和碱基切除酶5（ALKBH5）负责。m6A修饰的mRNA被“reader”蛋白如胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白（IGF2BP）家族成员识别，从而影响mRNA的细胞命运，包括可变剪接、核输出、稳定性和翻译。m6A修饰因子的异常表达以及全局m6A水平的改变已被证实与癌症进展和临床结果密切相关。值得注意的是，癌症细胞中METTL3和METTL14的异常上调会增加关键EMT诱导mRNA上的m6A积累，从而增强其稳定性并促进EMT。

环状RNA（circRNA）是一种由前mRNA通过反向剪接形成的共价闭合单链RNA分子。其环状结构使其对核酸酶介导的降解具有更高的抵抗力，从而比其线性同源mRNA具有更强的稳定性。最初被认为是剪接异常，circRNA现在正被重新认识为具有独特调控功能的RNA分子。circRNA可以作为支架或诱饵，影响大分子间的相互作用，如RNA-蛋白和蛋白-蛋白相互作用。此外，circRNA还可以通过“海绵”作用与微小RNA（miRNA）结合，阻止其与目标mRNA结合。一些circRNA甚至能够被翻译成功能性多肽。越来越多的证据表明，circRNA的失调与癌症的发生和发展密切相关。

在这项研究中，我们探讨了由TGFBR1和TGFBR2前mRNA衍生的circRNA是否会影响TGF-β/SMAD信号通路。我们识别出circTGFBR2(3-6)作为一种强大的TGF-β/SMAD信号通路增强因子。circTGFBR2(3-6)作为支架，促进RNA结合蛋白IGF2BP3与TGFBR1mRNA的相互作用，从而在m6A依赖的方式下增强其稳定性并促进其表达。因此，circTGFBR2(3-6)增强了TGF-β诱导的EMT、迁移、外渗、干细胞样特性和化疗耐药性。我们的研究结果突出了circTGFBR2(3-6)作为TGF-β/SMAD信号通路的关键增强因子，并且突出了其作为调节癌细胞可塑性的潜在治疗靶点。

为了进一步验证circTGFBR2(3-6)对TGF-β/SMAD信号通路的影响，我们进行了多种实验。首先，我们使用shRNA特异性靶向其独特的反向剪接接头（BSJ）序列，以选择性地耗尽circTGFBR2(3-6)。随后，在稳定表达SMAD3/4驱动的合成报告基因CAGA12-dynGFP的MDA-MB-231三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中，我们进行了功能丧失的筛选。结果表明，circTGFBR2(3-6)的敲除，而不是其他circRNA，抑制了TGF-β诱导的转录反应，其抑制效果与敲除TGFBR1或TGFBR2mRNA相当。我们进一步验证了circTGFBR2(3-6)的内部外显子组成，并通过PCR和Sanger测序确认了其来源于TGFBR2前mRNA的外显子3至6。此外，我们通过RNase R处理验证了circTGFBR2(3-6)对RNA酶降解的抵抗性，从而确认其为circRNA。通过亚细胞分馏和RT-qPCR分析，我们发现circTGFBR2(3-6)主要定位于MDA-MB-231和MCF10A-M2细胞的细胞质中。这一结果通过原位杂交进一步确认，使用靶向BSJ序列的探针在MDA-MB-231和非小细胞肺癌腺癌A549细胞中观察到circTGFBR2(3-6)的信号。

接下来，我们探讨了circTGFBR2(3-6)如何促进TGF-β/SMAD信号通路。通过RNA pull-down和质谱分析，我们确定了与circTGFBR2(3-6)相互作用的蛋白质，其中IGF2BP3作为关键的RNA结合蛋白被进一步研究。RNA pull-down和RNA免疫沉淀（RIP）结合RT-qPCR分析确认了circTGFBR2(3-6)与IGF2BP3的相互作用。我们假设IGF2BP3通过结合TGFBR1mRNA来介导circTGFBR2(3-6)的作用。实验结果表明，IGF2BP3与TGFBR1mRNA相互作用，并且这种相互作用在circTGFBR2(3-6)敲除后减弱。这表明circTGFBR2(3-6)可能作为IGF2BP3和TGFBR1mRNA之间的支架，以增强它们的相互作用。为了进一步验证这一机制，我们进行了RNA截断突变实验，并利用基序预测工具IntaRNA识别了circTGFBR2(3-6)与TGFBR1mRNA之间的可能结合区域。此外，我们还进行了基因编辑实验，通过CRISPR-Cas9系统删除了TGFBR1 3′UTR中与m6A修饰相关的序列，以观察其对IGF2BP3结合的影响。

我们进一步探讨了IGF2BP3如何通过circTGFBR2(3-6)促进TGF-β/SMAD信号通路。通过表达IGF2BP3的载体，我们观察到其能够显著增强TGFBR1mRNA和蛋白的表达，从而促进TGF-β诱导的EMT和细胞迁移。我们还发现，IGF2BP3的表达在基底型乳腺癌细胞系中高于在腔型细胞系中，这表明其在促进肿瘤形成中的作用。通过使用不同的实验方法，我们排除了circTGFBR2(3-6)可能通过翻译小肽或通过海绵作用miRNA来发挥其功能的可能。此外，我们还验证了circTGFBR2(3-6)是否通过调控TGFBR1mRNA的稳定性来增强TGF-β/SMAD信号通路。

我们的研究结果表明，circTGFBR2(3-6)通过促进IGF2BP3与TGFBR1mRNA的相互作用，增强了TGF-β/SMAD信号通路，从而推动了乳腺癌细胞的EMT、迁移、外渗、干细胞样特性和化疗耐药性。这些发现不仅揭示了circTGFBR2(3-6)作为TGF-β/SMAD信号通路增强因子的新机制，还突出了其作为潜在治疗靶点的重要性。此外，我们还探讨了IGF2BP3如何通过结合m6A修饰的TGFBR1mRNA来增强其稳定性，从而促进TGF-β/SMAD信号通路。这些研究结果为理解circRNA在癌症进展中的作用提供了新的视角，并为开发针对circTGFBR2(3-6)的治疗策略提供了理论依据。