一种非G-四聚体血红素适配体能够形成更优秀的过氧化物酶模拟物——DNA酶

《ChemBioChem》：A Non-G-Quadruplex Hemin Aptamer Forms a Better Peroxidase Mimicking DNAzyme

过氧化酶模拟DNAzyme Hem1-2T与G4型PS2.M在pH依赖性催化活性、血红素稳定性及结构响应上存在显著差异。Hem1-2T的活性随pH升高而降低，与HRP特性一致，且能更有效保护血红素免受H2O2降解。NMR显示Hem1-2T与血红素结合后形成稳定单核苷酸复合物，而PS2.M结合导致结构解离。研究证实非G4 aptamer Hem1-2T在催化效率和稳定性上优于传统G4 DNAzyme，为生物传感器和催化应用提供新思路。

　　本研究聚焦于一种非G四链体的适配子Hem1-2T与血红素（hemin）结合后表现出类似过氧化物酶（HRP）的催化特性。通过与已知的G四链体适配子PS2.M进行比较，发现Hem1-2T在pH依赖性催化活动方面与HRP更为相似，同时其对血红素的保护能力也更强。这些特性表明Hem1-2T可能是一个更有效的过氧化物酶模拟物，具有在生物分析和生物催化领域应用的潜力。

过氧化物酶是一类在细胞内执行氧化反应的关键酶，它们通过依赖过氧化氢（H?O?）的机制催化多种电子供体底物的氧化。这些酶通常包含血红素作为辅因子，其核心结构为铁（III）原卟啉IX（hemin）。血红素的催化作用涉及其对O-O键的裂解，形成中间产物（化合物I至IV），并在反应过程中稳定高氧化态的铁离子。由于其在不同底物上的广泛应用性、快速反应动力学以及温和的反应条件，过氧化物酶在生物分析化学中具有重要价值，尤其在生物传感器、农业和食品研究以及环境监测等应用中表现突出。

然而，蛋白质来源的过氧化物酶存在稳定性较差、生产成本高以及难以进行序列设计等局限性，这促使研究人员寻找过氧化物酶的替代物。近年来，DNA酶（DNAzymes）因其结构的可设计性、高稳定性和较低的成本，成为过氧化物酶模拟的有力候选。最早的过氧化物酶模拟DNAzymes是由Sen团队从结合卟啉的适配子中筛选出的，其基于G四链体（G-quadruplex, G4）结构。此类DNAzymes通常依赖于血红素作为辅因子，并在特定pH条件下展现出催化活性。不过，G四链体DNA能够结合多种平面分子，这导致其在某些应用中缺乏特异性，同时血红素在G四链体存在下也更容易被氧化降解，从而限制了其在实际分析中的应用。

为了克服这些局限，本研究中实验室通过一种名为“捕获-SELEX”的方法筛选出了一种新的血红素结合适配子Hem1-2T。通过等温滴定热量计（ITC）测定，Hem1-2T与血红素的解离常数（Kd）为43 nM，表明其对血红素具有较高的亲和力。此外，通过分析其碱基组成、盐依赖性结合以及圆二色光谱（CD）数据，确认Hem1-2T并不形成G四链体结构。这使得Hem1-2T成为一种非G四链体的过氧化物酶模拟物。值得注意的是，Hem1-2T的催化活性在Li?的存在下显著增强，而K?和Na?则表现出较弱的促进作用。这一发现进一步表明Hem1-2T可能具有不同于传统G四链体DNAzymes的催化机制。

为了深入探讨Hem1-2T的催化特性，研究人员对其在不同pH条件下的催化活性进行了系统研究。实验结果显示，在pH 6至8的范围内，Hem1-2T与血红素形成的复合物的催化活性随着pH的升高而逐渐降低，这一趋势与HRP的pH依赖性催化活性高度相似。相比之下，PS2.M的催化活性在相同pH范围内呈现出相反的趋势，即随着pH升高而增加。这种差异提示我们，Hem1-2T可能在某些方面更接近HRP的催化机制。此外，Hem1-2T在pH 6.0条件下，其产物吸收值在20分钟内达到0.7，且未出现饱和现象，这表明其具有更高的催化稳定性，能够在更长的时间内维持活性。

与Hem1-2T的催化行为不同，PS2.M在pH 8.0条件下，其催化活性在10分钟内达到平台期，但此时仍有大量未被氧化的底物存在。这提示PS2.M可能在较高pH条件下导致血红素的快速降解，从而影响其催化活性的持续性。实验还发现，PS2.M在pH 8.0条件下，血红素的降解速率约为Hem1-2T的95倍，这进一步说明了Hem1-2T在维持血红素稳定性方面的优势。这种稳定性可能源于Hem1-2T与血红素结合的方式不同，使其在氧化条件下能够更有效地保护血红素不被破坏。

为了进一步比较Hem1-2T和PS2.M的催化效率，研究人员采用了米氏方程（Michaelis-Menten equation）对两者的催化常数（Km）和最大反应速率（Vmax）进行了分析。结果显示，Hem1-2T与血红素结合后对ABTS（一种常用的过氧化物酶活性检测底物）的Km值为69 ± 6 μM，而PS2.M的Km值为122 ± 5 μM。这意味着Hem1-2T对ABTS的结合能力更强，从而在催化过程中表现出更高的效率。尽管两者的Vmax值相近，但Hem1-2T在低浓度H?O?条件下展现出更优的催化性能，这可能与其对血红素的稳定保护能力有关。

除了对底物浓度的依赖性，研究人员还通过紫外-可见光谱（UV-Vis）技术研究了催化过程中产生的中间产物。血红素与DNAzymes结合后，在H?O?的作用下会经历一系列氧化反应，形成不同的中间态。例如，血红素与DNAzymes结合后，Soret吸收带的峰位和强度变化可以反映催化反应的进程。实验发现，Hem1-2T与血红素形成的复合物在H?O?处理后，其Soret吸收带保持较高强度和稳定位置，这表明其在催化过程中对血红素的保护能力更强。而PS2.M与血红素结合后，其Soret吸收带强度迅速下降，这可能与其导致血红素降解的催化机制有关。这种差异进一步支持了Hem1-2T作为更优过氧化物酶模拟物的假设。

为了揭示Hem1-2T和PS2.M在血红素结合过程中的结构变化，研究人员采用了核磁共振（NMR）光谱技术进行分析。NMR结果显示，Hem1-2T在与血红素结合后，其信号峰显著增加，表明形成了更多的碱基配对，包括Watson-Crick配对和非典型配对。这说明Hem1-2T在结合血红素后能够发生结构重塑，从而形成一个稳定的DNA-hemin复合物。相比之下，PS2.M在与血红素结合后，其信号峰变得模糊甚至消失，这可能是因为PS2.M与血红素结合时采用了多种构象，导致NMR信号的广度增加。此外，PS2.M的结构可能更容易受到血红素中顺磁性铁离子的影响，从而导致信号的进一步宽化。这些结构上的差异可能直接导致了两者在催化效率和稳定性上的显著不同。

研究还发现，Hem1-2T在pH依赖性催化活动方面表现出更高的稳定性。在pH 6.0条件下，其催化活性达到最佳状态，且血红素在该条件下不易降解。这使得Hem1-2T能够在更广泛的pH范围内保持较高的催化效率。而PS2.M则在pH 8.0条件下表现出最佳活性，但此时血红素的降解速率显著加快，导致其催化活性的持续时间较短。这种现象可能与PS2.M的结构特性有关，其在高pH条件下更容易与血红素发生相互作用，从而加速其降解。

此外，实验还发现Hem1-2T对盐浓度的耐受性更高。在没有特定盐离子的情况下，Hem1-2T仍然能够维持其催化活性，而PS2.M则在去除K?后失去了活性。这表明Hem1-2T的催化机制可能更加灵活，能够在不同的离子环境中保持其功能。这一特性使其在实际应用中具有更大的适应性，特别是在需要避免使用特定离子或在复杂环境中工作的场景中。

综上所述，Hem1-2T作为一种非G四链体的过氧化物酶模拟物，在多个方面表现出优于PS2.M的特性。它不仅在pH依赖性催化活动上与HRP更加相似，还能够更有效地保护血红素不被降解，从而延长其催化寿命。此外，Hem1-2T对盐浓度的耐受性更高，表现出更强的结构稳定性和催化效率。这些优势使得Hem1-2T成为一种更有前景的过氧化物酶替代物，尤其是在需要高稳定性和特异性的情况下。未来，Hem1-2T有望在生物传感器、环境监测和生物催化等领域发挥重要作用，为相关研究提供新的工具和思路。