由癌症相关突变诱导的BRCA1相关蛋白-1（BAP1）聚集特性的研究

《ChemBioChem》：Characterization of BRCA1-Associated Protein-1 (BAP1) Aggregation Properties Induced by Cancer-Associated Mutations

研究BAP1-UCH域四个致癌突变体（N78S、C91W、F81V、G128R）的聚集机制，发现均遵循次级成核主导模型，其中F81V和G128R聚集速率最快，因结构 destabilization导致核输入受阻，胞质聚集增强，促进癌症进展。

　　本研究聚焦于BAP1蛋白中与癌症相关的突变对其UCH结构域聚集行为的影响，揭示了这些突变如何导致蛋白质的异常聚集，并进而影响其肿瘤抑制功能。BAP1是一种重要的肿瘤抑制蛋白，其主要功能包括调控DNA转录、细胞周期、细胞存活、DNA损伤修复以及DNA复制等。它通过其去泛素化酶（DUB）活性参与多种细胞过程，如通过与HCF-1和YY1形成复合物调控COX7C基因的表达，从而影响线粒体功能；通过与ASXL1/2结合形成PR-DUB复合物，调控组蛋白泛素化状态，进而影响DNA转录；通过稳定INO80蛋白，促进DNA复制并缓解复制压力；以及通过稳定IP3R3蛋白，调控细胞凋亡过程。这些功能表明，BAP1的正常结构和功能对于细胞健康至关重要，任何结构或功能上的异常都可能引发细胞的异常行为，最终导致癌症的发生和发展。

在BAP1的UCH结构域中，存在多个与癌症相关的突变位点，其中N78S、C91W、F81V和G128R是研究的重点。这些突变不仅影响BAP1的结构稳定性，还可能导致其在细胞内的异常聚集，进而影响其进入细胞核的能力。BAP1的核定位信号（NLS）使其能够被运输至细胞核，以执行其去泛素化功能。然而，某些突变可能破坏这种运输机制，导致BAP1在细胞质中积累，无法有效进入细胞核，从而无法发挥其正常的肿瘤抑制作用。这种现象在多种癌症中被观察到，例如恶性间皮瘤和视网膜黑色素瘤等。

为了深入理解这些突变如何影响BAP1的聚集行为，研究者采用了多种实验方法。其中包括使用Thioflavin T（ThT）荧光结合实验来监测蛋白质聚集过程，并结合AmyloFit分析工具来解析聚集机制。研究发现，所有突变体都遵循一种以二次成核为主的聚集模型，这种模型在许多无序蛋白中较为常见。此外，这些突变体表现出显著的浓度依赖性，其聚集速率远高于野生型（WT）BAP1。这表明，即使在生理条件下，这些突变体也能迅速形成聚集，而无需像许多其他蛋白质那样依赖极端环境条件（如低pH或高温）来启动聚集过程。

研究还通过不同方法进一步探讨了BAP1-UCH突变体的聚集行为。例如，使用远紫外圆二色光谱（Far-UV CD）分析了蛋白质在聚集过程中的二级结构变化。结果表明，所有突变体在聚集过程中都表现出α-螺旋结构的减少和β-折叠结构的增加，这与ThT荧光信号的变化一致。这种β-折叠结构的形成是蛋白质聚集的典型特征，表明这些突变体可能形成了具有结构特性的淀粉样纤维。此外，动态光散射（DLS）实验用于监测BAP1-UCH突变体的寡聚化进程，发现F81V和G128R的寡聚速率远高于其他突变体和野生型蛋白，这进一步支持了它们更容易形成淀粉样纤维的观点。

为了更全面地了解这些突变对BAP1-UCH结构的影响，研究者还使用了AlphaFold预测蛋白质的三维结构，并结合AGGRESCAN4D工具分析其聚集倾向。结果表明，尽管某些预测工具可以较好地反映蛋白质的折叠稳定性，但实际的聚集行为可能更加复杂，受到多种因素的影响，如蛋白质浓度、环境条件以及突变引起的结构变化。例如，F81V和G128R的聚集倾向被实验数据证实为最强，而它们的结构变化也可能导致其更容易发生二次成核过程。相比之下，N78S和C91W虽然在聚集行为上表现出一定的浓度依赖性，但它们的聚集速率和结构稳定性仍然低于F81V和G128R。

在形态学和结构特征方面，研究者通过透射电子显微镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）对形成的淀粉样纤维进行了详细分析。TEM图像显示，野生型BAP1-UCH主要形成类似蠕虫的原纤维结构，而N78S、C91W、F81V和G128R则形成更长、更稳定的纤维结构。FTIR分析进一步支持了这一结论，表明所有突变体的纤维结构均富含β-折叠结构，这是淀粉样纤维的典型特征。这些结果表明，突变不仅改变了BAP1-UCH的结构稳定性，还显著影响了其在细胞内的聚集行为。

此外，研究还探讨了BAP1-UCH突变体在细胞内的实际行为。通过免疫荧光显微镜观察，发现N78S和G128R突变体在细胞中表现出明显的核周聚集现象，而野生型BAP1则未出现这种现象。这表明，这些突变体可能由于无法有效进入细胞核，导致其在细胞质中积累并形成毒性寡聚体，进而影响细胞功能。这种核周聚集现象在多种肿瘤抑制蛋白中也有报道，如p53蛋白，其突变导致蛋白质结构不稳定，增加其聚集倾向，最终引发功能丧失和肿瘤发展。

从理论预测的角度来看，研究者利用AGGRESCAN和AGGRESCAN4D工具对BAP1-UCH突变体的聚集倾向进行了预测。然而，实验数据表明，某些突变体的实际聚集行为与预测结果存在差异。例如，AGGRESCAN预测F81V和G128R的聚集倾向较低，但实验数据显示它们的聚集速率显著高于其他突变体。这提示我们，仅依赖序列或结构信息可能无法完全预测蛋白质的聚集行为，特别是当突变引起蛋白质结构的局部不稳定时，这种不稳定性可能在聚集过程中起到关键作用。

研究还探讨了二次成核过程的随机性如何影响BAP1-UCH突变体的聚集行为。二次成核通常受到环境波动和分子噪声的影响，导致聚集的起始时间和空间分布具有较大的异质性。这种随机性在实验中表现为不同突变体的聚集参数（如k?和n?）存在较大的标准差，表明它们的聚集过程受到多种因素的影响。因此，预测BAP1突变体的聚集行为需要考虑更多的实验条件和环境因素，而不仅仅是蛋白质序列或结构。

综上所述，本研究通过多种实验手段，揭示了BAP1-UCH突变体在聚集过程中的不同行为。这些突变不仅影响BAP1的结构稳定性，还可能通过不同的机制促进其聚集，进而影响其功能和细胞行为。研究结果表明，BAP1的异常聚集可能在癌症的发生和发展中起到重要作用，尤其是在核周聚集的情况下，这种聚集可能导致细胞功能的紊乱和毒性效应。因此，理解BAP1突变如何影响其聚集行为，对于揭示其在癌症中的作用机制以及开发相关治疗策略具有重要意义。未来的研究可能需要进一步探索这些突变在不同细胞环境下的具体影响，以及如何通过干预聚集过程来恢复BAP1的正常功能。