甲苯胺蓝衍生物与人血清白蛋白的生物偶联物及其与葫芦[7]脲基的复合物作为光动力疗法的药物递送载体

《ACS Omega》：Bioconjugates of Toluidine Blue Derivatives with Human Serum Albumin and Their Complexes with Cucurbit[7]uril as Drug Delivery Vehicles for Photodynamic Therapy

光动力疗法（PDT）研究：利用HSA共价结合与CB[7]包合的TBO衍生物，系统优化了细胞摄取（HSA增强5-15倍）与光毒性（平衡荧光寿命、量子产率及摄取效率），发现共价键类型（二硫键/硫醚键）影响内源性释放及稳定性，而CB[7]通过氢键稳定药物并提升光物理性质。

　　光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）作为一种癌症治疗手段，因其非侵入性和靶向性而受到广泛关注。PDT通常涉及三种关键成分：光敏剂（Photosensitizer, PS）、特定波长的光以及分子氧。在治疗过程中，光敏剂被引入体内并积累在癌细胞中，随后在光照射下激发产生具有细胞毒性的活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS），从而诱导癌细胞死亡。然而，传统的PDT在实际应用中面临诸多挑战，如光敏剂在水中的溶解性较差、对正常组织的选择性不足以及难以有效递送至目标细胞。为了解决这些问题，研究人员开发了多种药物递送系统（Drug Delivery Systems, DDS），包括纳米颗粒、脂质体、肽、蛋白质以及大环分子等。其中，人类血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）和葫芦[7]脲（Cucurbit[7]uril, CB[7]）因其独特的性质而成为研究的重点。

HSA是血液中最丰富的蛋白质之一，约占血浆蛋白的60%，具有多种结合能力，包括对药物、脂质体和大分子的结合。HSA的一个关键特性是其含有一个游离的半胱氨酸残基（Cys34），该残基可以用于共价连接药物，从而增强其在体内的稳定性和靶向性。此外，HSA通过增强渗透和滞留效应（Enhanced Permeability and Retention Effect, EPR效应）和特定受体如gp60和SPARC，可以显著提高药物在肿瘤细胞中的摄取效率。然而，HSA的结合也可能导致光敏剂的荧光淬灭和单线态氧（Singlet Oxygen, ¹O₂）生成能力的下降，这可能会影响PDT的疗效。

另一方面，CB[7]是一种由甘油尿素单元在酸性条件下缩合而成的大环分子，具有低细胞毒性、高药物结合亲和力和良好的生理介质溶解性。CB[7]能够形成稳定的包合物，从而保护光敏剂免受外界环境的影响，同时增强其光物理和光化学性质，如荧光强度和单线态氧生成效率。这些性质对于PDT的应用至关重要，因为更高的单线态氧生成效率意味着更强的细胞毒性。

本研究旨在探讨将两种TBO衍生物共价连接至HSA，并结合CB[7]作为保护性纳米胶囊，以评估其对HeLa细胞的摄取效率和光毒性。TBO是一种成本低廉的阳离子苯并噻唑衍生物，具有低毒性、在可见光区域（约626 nm）激发以及较高的单线态氧量子产率（Φ_Δ）。此外，TBO还显示出对核酸、脂多糖和细胞膜的高亲和力，这使其成为一种具有潜力的PDT光敏剂。通过将TBO与HSA进行共价连接，研究人员能够利用HSA的靶向性和生物相容性，同时通过CB[7]的包合作用增强光敏剂的稳定性。

在实验中，研究人员合成并评估了两种TBO衍生物（TBOPDP和TBOEMC）的光物理性质，并研究了它们与HSA和CB[7]的相互作用。实验结果显示，当TBO衍生物与CB[7]形成包合物时，它们的吸收和发射光谱均发生了蓝移（hypsochromic shift），同时荧光强度有所增强。这一现象可能与CB[7]的空腔结构有关，该结构能够提供一个低极化环境，从而减少非辐射衰减路径，提高光敏剂的荧光寿命。此外，荧光寿命的增加也表明了光敏剂在CB[7]空腔中的运动受到限制，这有助于提高其在体内的稳定性和光化学效率。

研究人员还通过分子对接技术研究了TBO衍生物与CB[7]的结合能力，发现这些衍生物能够与CB[7]形成稳定的1:1摩尔比包合物。结合常数（K_b）的测定表明，TBO衍生物与CB[7]的结合能力虽然略低于TBO本身，但仍然显著高于其他大环分子如环糊精。这说明CB[7]在增强光敏剂性能方面具有重要作用。此外，分子对接结果还揭示了TBO衍生物与CB[7]之间形成的氢键，这些氢键可能进一步稳定了包合物的结构。

在细胞摄取实验中，研究人员发现HSA作为DDS能够显著提高TBO衍生物的细胞摄取效率。与自由的TBO衍生物相比，HSA-TBOPDP和HSA-TBOEMC的摄取量分别增加了5倍和15倍。这一结果表明，HSA在PDT中的作用不仅限于药物递送，还能够通过其与细胞受体的相互作用增强光敏剂的摄取。然而，当HSA与TBO衍生物形成包合物时，其摄取效率有所下降，这可能与HSA的结构特性有关。CB[7]的加入对不同衍生物的摄取产生了不同的影响，对于TBOPDP，CB[7]的结合显著降低了其摄取效率；而对于TBOEMC，CB[7]的加入反而提高了其摄取效率。这种差异可能与TBOEMC较长的烷基链有关，该链可能有助于其更有效地从CB[7]空腔中释放，从而增加其在细胞内的积累。

在光毒性研究中，研究人员发现HSA-TBOPDP和HSA-TBOEMC在光照下均表现出显著的细胞毒性。然而，HSA-TBOPDP的光毒性略高于HSA-TBOEMC，这可能与其共价连接方式有关。TBOPDP通过二硫键与HSA的Cys34残基连接，而二硫键在细胞内容易被还原剂如谷胱甘肽分解，从而释放光敏剂。这种释放机制可能有助于提高光敏剂在细胞内的浓度，进而增强其光毒性。相比之下，HSA-TBOEMC通过硫醇-迈克尔加成反应形成更稳定的硫醚键，这可能导致其在细胞内的释放受到抑制，从而降低其光毒性。

此外，研究人员还发现，当TBO衍生物与CB[7]形成包合物时，其光毒性略有变化。对于TBOPDP，CB[7]的结合显著降低了其光毒性；而对于TBOEMC，CB[7]的结合反而提高了其光毒性。这一结果表明，CB[7]对不同光敏剂的影响可能与其结构特性有关。例如，TBOPDP的二硫键可能在CB[7]的保护下变得更加稳定，从而减少其在细胞内的释放；而TBOEMC的硫醚键可能在CB[7]的环境中更容易发生逆迈克尔反应，从而增加其在细胞内的释放效率。

综上所述，本研究通过将TBO衍生物与HSA进行共价连接，并结合CB[7]作为保护性纳米胶囊，探讨了其对HeLa细胞摄取效率和光毒性的影响。实验结果表明，HSA能够显著提高光敏剂的摄取效率，而CB[7]则能够增强光敏剂的光物理和光化学性能。尽管HSA的结合可能导致光敏剂的荧光淬灭和单线态氧生成效率的降低，但其高摄取能力能够有效补偿这一缺点，从而提高PDT的整体效果。另一方面，CB[7]的加入对不同光敏剂的影响不同，这可能与其结构特性和与HSA的相互作用有关。通过优化这两种系统的结合方式，研究人员能够更有效地提高PDT的疗效，为癌症治疗提供新的思路和方法。