综述：烟酰胺辅酶仿生设计：构效关系研究

《ACS Catalysis》：Nicotinamide Cofactor Biomimetics: Design and Structure Activity Relationships

本综述系统阐述了烟酰胺辅酶仿生物（NCBs）作为天然NAD(P)H替代物的设计策略与构效关系（SAR）。文章重点分析了简单NCBs（如BNAH、BuNAH）的结构修饰（包括尾部基团、头部基团及烟酰胺环修饰）对其氧化还原电位、酶亲和性、稳定性及生物正交性的影响，并探讨了酶法、电化学等多种NCB再生方法。该工作为开发低成本、高活性仿生辅酶提供了重要SAR见解，对推动氧化还原酶在生物制造中的应用具有指导意义。

　　

1. 引言

生物催化因其可持续性指标及卓越的区域、化学和立体选择性而成为备受青睐的方法。在众多生物催化剂中，氧化还原酶能催化多种底物的氧化还原转化，因而在合成应用中极具吸引力。然而，许多氧化还原酶依赖烟酰胺类辅因子，这类辅因子高昂的成本和较差的原子经济性可能抵消生物合成过程的优势。使用烟酰胺辅酶仿生物（NCBs）替代天然辅因子（如NADH或NADPH）可有效解决这些问题。此外，NCBs凭借其扩展的氧化还原特性结构，有望增强酶活性，为反应性和生物正交性开辟了新可能性。

1.1. NCBs概述

NCBs可分为二核苷酸、单核苷酸或简单仿生辅因子三类。二核苷酸辅酶仿生物保留NAD(P)(H)的大部分结构，仅对头部和/或核糖基团进行微小修饰。单核苷酸仿生物则进一步截短第二个核苷酸部分（即失去尾部）。这两类修饰保留了酶活性位点分子识别的关键官能团，且未显著增加合成难度或成本。简单辅酶仿生物则对尾部基团进行重大修改，用烷基或芳基取代核苷酸，虽降低了辅因子成本，但可能显著改变酶活性位点的分子识别特性。

1.2. 二核苷酸和单核苷酸NCBs

对NAD(P)(H)的微小修饰已被证明可提高NCBs的稳定性和活性。例如，将核糖环中的氧原子替换为CH₂基团（cNAD⁺）可使辅因子的半衰期延长至NADP⁺的约30倍。将羧酰胺基团替换为羧酸可得NaADP(H)，其还原电位低至-400 mV，且能被内源性细胞酶还原。此外，简单水解NADP⁺的二磷酸部分可获得单核苷酸NCBs，如烟酰胺单核苷酸（NMN）。通过酶工程改造，可使天然接受NAD⁺的酶转而接受NMN，从而实现与NAD⁺途径的生物正交性。

1.3. 简单NCBs

简单NCBs的结构与天然烟酰胺辅因子差异显著，通常不易被氧化还原酶接受。然而，依赖黄素（FMN）的氧化还原酶能与简单NCBs良好配合。其机制涉及氢化物向黄素的量子隧穿转移，该过程对氢化物供体与受体分子的取向和距离高度敏感。值得注意的是，NCBs可在酶的首次氢化物转移中替代NAD(P)H。黄素和酶活性位点可容纳酶的偏好底物，因此NCB仅需向黄素这一氢化物受体进行氢转移，这一步的严格性可能低于直接向底物转移氢化物。

首个报道的简单NCB——1-苄基-1,4-二氢吡啶-3-甲酰胺（BNAH）仍是应用最广泛的NCB。后续研究报道了具有正丁基（BuNAH）或乙酰胺（AmNAH）尾部基团的NCB。改变NCB尾部可 alter 其反应性；例如，Hollman、Scrutton及其合作者报道了这些简单NCBs可增强酶活性。此外，对简单NCBs的烟酰胺环进行修饰（如将酰胺基团替换为乙酰基、羧酸或氰基）可显著影响二氢吡啶环的电子特性，从而精细调控NCB活性。

2. 近期报道的NCBs

2.1. 烟酰胺环的变体

在烟酰胺环C5位引入甲基（如5-Me-BNAH和5-Me-BuNAH）是近期有趣的NCB变体。该修饰增加了烟酰胺环的电子密度，表现为更强的还原电位。增加的电子密度可能稳定辅因子氧化时氮原子上的正电荷，从而使其成为更强的还原剂。

2.2. BNAH的变体

BNAH为衍生化提供了通用支架。常见的修饰包括延长烟酰胺与第二个环（Ring 2）之间的碳连接链，如两碳（P2NAH）至五碳（P5NAH）连接链。研究表明，延长连接链的NCBs（如P2NAH、P4NAH）在某些工程化葡萄糖脱氢酶中表现出比BNAH更高的活性。此外，对BNAH的第二个环进行官能团修饰（如羧酸、羟基、甲氧基、氟、三氟甲基等）也可影响其活性，其中某些修饰（如羧酸）为NCB提供了与活性位点更有效结合的潜在“手柄”。

2.3. 烷基取代NCBs的变体

研究也探索了具有烷基链尾部的简单NCBs，如丙基（ProNAH）和乙基（EtNAH）。这些新型NCBs在亚胺还原酶反应中成功替代NADPH，保持了反应的催化活性和立体选择性。然而，也有报道称在BuNA⁺烷基链末端添加羧酸基团后，未能成功还原该NCB，提示某些修饰可能阻碍其功能。

3. NCBs的构效关系（SAR）

NCBs的实用性取决于其结构与功能特性（如溶解度、酶亲和力、氧化还原电位及酶促反应净活性）之间的关系。研究表明，连接链长度对NCB性能有显著影响。例如，与BNAH相比，P2NAH和P3NAH在特定酶（如LpNOX）中表现出更低的K_m值和更高的V_max值。在烟酰胺环C5位引入甲基可增强NCB的氢化物捐赠能力，但计算对接显示，甲基可能与酶活性位点残基形成疏水相互作用，导致氧化型NCB产物抑制，反而降低酶促转化率。

对NCB第二个环上官能团效应的研究发现，给电子基团（如甲氧基）可增强还原能力，而吸电子基团则起抑制作用。有趣的是，连接链长度也能影响NCB的还原能力，较长连接链通常增强还原电位。计算模型表明，连接链中增加的亚甲基允许两个环发生π堆积，这种边对面稳定相互作用有利于NCB氧化，从而贡献于其更强的还原能力。

稳定性是NCBs应用的另一个关键考量。近期计算研究利用密度泛函理论（DFT）预测了NCBs在磷酸盐缓冲液中的稳定性，发现质子化发生在烟酰胺C5位。模型预测显示，直接将氮原子连接到芳基基团、使用醛基作为头部基团以及在二氢吡啶环C5位引入甲基均可增强NCB稳定性。

4. NCBs的再生

NCBs在生物合成中氧化还原状态相互转换的方法包括过渡金属催化、酶催化、化学还原、光化学还原和电催化。每种方法各有优劣：过渡金属催化（如铑、钌、铱催化剂）选择性高，但金属昂贵且可能产生有机金属废物；化学还原法（如连二亚硫酸钠、硼氢化钠）成本低，但需要化学计量还原剂，可能产生非活性副产物且对酶有毒性；酶法再生（如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶）选择性高、废物少，但可能需要酶工程改造以适应NCB结构，且通常需要牺牲底物；电化学方法可利用清洁电能、废物产生极少，但可能选择性差，需使用氧化还原介质以确保区域选择性还原。

5. 结论

NCBs作为天然烟酰胺辅因子的替代物，在降低成本和提升反应活性方面展现出巨大潜力。然而，其再生、稳定性和溶解度等问题仍有待完全解决。当前文献在NCB合成、应用报道与其系统性的构效关系（SAR）研究之间存在缺口。填补这一缺口，特别是通过计算建模和标准化表征方法的结合，将有力推动更高效还原当量的开发，为生物催化和绿色化学的发展注入新动力。