一种氟化的Janus型树状大分子，可用作核酸的可电离单组分纳米载体

《Nanoscale》：A fluorinated Janus-type dendrimer as an ionizable one-component nanocarrier for nucleic acids

基因治疗中，核苷酸（NAs）递送载体面临细胞内摄取效率低、易被酶降解等问题。本研究设计了一种第二代氟化Janus型树状大分子（FJD2N），通过支链氟化基团增强疏水性和自组装能力，利用初级氨基实现与NAs的电荷辅助氢键结合。实验表明，FJD2N在纯水中自发组装为5 nm的微胶粒，在氯化钠中形成更大的分数聚集体，并高效转染L929、SH-5YSY和C2C12细胞，转染效率与商业产品相当，细胞毒性显著降低。FJD2N的氟化结构还支持氟-19 MRI追踪，为临床可视化递送过程提供可能。

　　基因疗法是现代医学中用于治疗和预防多种疾病的重要手段，而基于核酸（NAs）的基因疗法作为新兴药物类别，正在快速发展。然而，核酸在细胞内运输过程中面临许多挑战，包括被酶降解以及其负电荷限制了膜渗透能力。为了解决这些问题，研究人员开发了多种非病毒载体，其中树枝状分子（dendrimers）因其化学可调性、多价结构和高载药量而受到关注。然而，高代数的树枝状分子合成成本较高，限制了其临床应用。因此，开发一种结构简单、具有自组装能力的替代性树枝状分子成为研究重点。本文中，我们设计并合成了一种第二代氟化Janus型树枝状分子（FJD?N），该分子结合了强疏水性自组装基团、适当数量的可质子化初级氨基以及一个氟化和亲水基团之间的最佳平衡。通过这种方式，FJD?N不仅能够高效地与核酸形成复合物（即dendriplexes），还能安全地将核酸运输到多种细胞类型中，实现有效的基因传递，同时保持较低的细胞毒性。

FJD?N的结构设计充分考虑了其在水溶液中的自组装特性。在生理条件下，该分子在水溶液中能直接分散，并在特定浓度下形成带正电荷的微粒，这些微粒在存在离子的情况下会进一步聚集，形成较大的分形结构。通过动态光散射（DLS）和冷冻透射电镜（Cryo-TEM）等技术，我们观察到FJD?N在水溶液中形成的微粒尺寸为约2 nm，而在存在氯离子时，微粒之间通过静电作用和氢键结合，形成更大的结构。此外，FJD?N还表现出良好的磁性特性，其1?F-MRI信号在不同浓度下均稳定，表明其在生物医学成像中具有应用潜力。

在研究过程中，我们对FJD?N的结构和性能进行了全面分析。通过分子动力学（MD）模拟，我们发现FJD?N的疏水和亲水部分体积相近，这一特性对于提高其基因传递效率至关重要。同时，FJD?N在水溶液中具有良好的自组装能力，能够在低浓度下形成稳定的微粒。在存在氯离子时，其自组装能力增强，导致形成更复杂的结构。这些结构的变化通过小角X射线散射（SAXS）和小角中子散射（SANS）进一步验证，表明FJD?N能够形成具有不同尺度的微粒和分形结构。1?F-NMR分析则显示了FJD?N在不同浓度下的磁性行为，包括其在水溶液中的单体和聚集态之间的信号差异。

FJD?N在与核酸形成复合物后，表现出优异的基因传递能力。我们通过荧光滴定实验和1?F-NMR实验，验证了FJD?N与RNA和DNA的结合能力。结果表明，FJD?N在N/P比接近2时，能够有效地与RNA结合，而与DNA结合则在N/P比为2.5时达到最佳效果。这种结合能力不仅表现在分子层面，也体现在细胞层面。在细胞实验中，FJD?N在多种细胞系中均表现出良好的转染效率，同时保持较低的细胞毒性。例如，在L929、SH-SY5Y和C2C12细胞中，FJD?N在N/P比为30时，细胞存活率与商用载体JetPEI?和Lipofectamine? 3000相当。此外，我们还使用共聚焦显微镜观察了FJD?N在C2C12细胞中的细胞内定位，发现其能够将siRNA有效地传递到细胞内，并在24小时内显著内化，与细胞质中的Desmin蛋白共定位。随着处理时间的延长，RNA信号强度有所下降，这可能与细胞增殖和RNA代谢有关。

FJD?N在生理条件下的表现也显示出其作为基因传递载体的优势。它在存在盐（如NaCl）的情况下，仍能保持良好的自组装特性，且在与核酸结合后，能够形成具有特定磁性信号的复合物。通过1?F-MRI实验，我们成功地在不同溶液中观察到FJD?N的信号，证明其作为基因传递载体的可视化能力。这些结果不仅表明FJD?N在基因传递方面的高效性，也显示出其在生物医学成像中的潜在价值。

此外，我们还对FJD?N的合成和表征方法进行了详细描述。FJD?N的合成基于已有的方法，并通过一系列化学反应步骤完成。合成过程中，使用了多种有机溶剂和试剂，包括四氢呋喃（THF）和氟化化合物，确保了产物的纯度和结构稳定性。通过核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术，我们对FJD?N的化学结构进行了表征，确认了其疏水性和亲水性基团的分布。1?F-NMR分析进一步验证了FJD?N在不同浓度下的磁性行为，表明其在不同环境中具有不同的信号特征。

在实验方法上，我们采用了多种分析手段来研究FJD?N的性能。包括动态光散射（DLS）用于测量其在水溶液中的自组装行为，以及电位测定用于评估其电荷特性。通过这些方法，我们能够更全面地了解FJD?N的物理化学性质，并验证其作为基因传递载体的可行性。同时，我们还对FJD?N的细胞毒性进行了评估，结果表明其在多种细胞系中均表现出较低的毒性，特别是在较低的N/P比下，细胞存活率较高。

总的来说，FJD?N作为一种结构简单、成本可控的非病毒基因传递载体，具有良好的自组装能力、高效的核酸结合能力以及较低的细胞毒性。其1?F-MRI信号在不同溶液中均稳定，能够用于追踪核酸的运输路径。通过一系列实验验证，FJD?N在不同细胞系中均表现出良好的转染效率，同时保持细胞活性。这些发现表明，FJD?N有望成为一种安全、高效的基因传递载体，适用于多种疾病治疗。未来的研究将进一步探索其在细胞内传递和生物效应的具体机制，以实现更广泛的应用。