机器学习揭示了巨噬细胞形态表型变化与种群密度的依赖关系

《Advanced Intelligent Systems》：Machine Learning Elucidates Population Density-Dependent Morphological Phenotypic Changes of Macrophages

巨噬细胞群体密度与形态特征的关系研究利用无标记相位对比显微成像和机器学习技术，揭示了高密度下巨噬细胞体积和半径显著减小，而形状特征变化不大。通过主成分分析和无监督聚类，识别了不同密度下的亚群结构，并评估了多种监督学习算法（如随机森林和逻辑回归）的分类性能，证实形态学特征可作为预测群体密度的有效指标。

　　本研究探讨了巨噬细胞群体密度与其形态特征之间的关系，以及这些形态特征是否可以作为预测细胞群体密度的指标。巨噬细胞是免疫系统中极为重要的组成部分，它们在调节多种生理活动和功能方面发挥着关键作用，包括识别和清除有害微生物、清除死亡细胞和细胞碎片，以及激活其他类型的免疫细胞。由于巨噬细胞在体内占据不同的位置并承担多种功能，它们之间存在显著的异质性。这种异质性不仅体现在功能和分泌的生化因子上，还反映在它们的生物物理属性上，包括形态特征。

研究表明，巨噬细胞的群体密度可能对其行为和功能产生重要影响。具体来说，群体密度的变化可能会影响巨噬细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等过程。例如，有研究发现，巨噬细胞分泌的炎症因子和趋化因子受到其分布密度的调控，而这些密度依赖的炎症反应在不同巨噬细胞表型中均有所体现。然而，尽管群体密度与功能之间的关系已被逐步确立，但其对巨噬细胞形态特征的具体影响仍然不清楚。因此，本研究旨在通过一种无标记的相位对比显微镜技术，结合机器学习方法，探索巨噬细胞群体密度与其形态特征之间的关系，并评估这些形态特征是否可以作为预测细胞群体密度的指标。

在实验中，研究人员使用了RAW 264.7小鼠巨噬细胞系作为模型细胞。虽然这种细胞系并不能完全代表所有巨噬细胞类型，但其易于培养且具有相对稳定的表型特征，使其成为本研究的合适选择。研究人员首先将巨噬细胞培养在T75烧瓶中，并在不同密度条件下进行培养。随后，利用相位对比显微镜对巨噬细胞群体进行成像，采集了多个随机区域的图像。为了提取细胞的形态特征，研究人员采用了基于监督随机森林分类器的像素分类方法，生成了概率图以区分细胞和背景区域。这些概率图被用来估算巨噬细胞的覆盖面积，并进一步生成图像掩膜以分割出单个细胞。通过这些图像掩膜，研究人员提取了多个与细胞大小和形状相关的特征，包括面积、等效直径、主轴长度、次轴长度、周长、平均半径和中位半径等大小特征，以及扩展度、偏心率、紧密度、紧凑度和形态因子等形状特征。

进一步的统计分析表明，不同密度的巨噬细胞群体在大小特征上表现出显著差异，而形状特征的变化则不明显。例如，低密度巨噬细胞的面积和直径显著大于高密度和中等密度的巨噬细胞。此外，其他大小特征如平均半径、中位半径和次轴长度也存在显著差异。然而，这些差异并未体现在形状特征上，这表明群体密度的变化主要影响的是巨噬细胞的大小，而非其形状。这一发现可能与巨噬细胞在不同密度下的空间约束和细胞间相互作用有关。例如，高密度的巨噬细胞群体由于细胞间接触更加紧密，可能受到更强的空间限制，从而影响其大小，但对形状的影响较小。

为了进一步评估不同密度巨噬细胞群体的形态异质性，研究人员采用了主成分分析（PCA）和无监督聚类方法。通过PCA，研究人员将高维的形态特征数据降维至两个主成分，这两个主成分能够解释超过80%的数据变异。随后，利用无监督的K均值聚类方法，研究人员识别出每个巨噬细胞群体内部可能存在的亚群。结果表明，每个巨噬细胞群体可以被划分为两个明显的亚群，这些亚群在形态特征上表现出显著的差异。进一步的统计分析也确认了这些亚群在大小和形状特征上的独特性。

为了评估哪些形态特征对巨噬细胞群体密度的预测具有更高的价值，研究人员采用了特征评分和排序的方法，基于方差分析（ANOVA）对不同特征的重要性进行了评估。结果显示，大小特征在所有细胞群体中均具有更高的区分能力，尤其是在低密度和高密度巨噬细胞群体之间。而形状特征的重要性相对较低，尤其是形态因子、扩展度、紧凑度和紧密度等。这表明，虽然形状特征在一定程度上反映了巨噬细胞的形态异质性，但它们在预测群体密度方面的贡献不如大小特征显著。

为了进一步验证这些特征的预测能力，研究人员采用了多种监督机器学习算法，包括逻辑回归、决策树、随机森林、极端梯度提升（XGBoost）和K近邻（KNN）算法。所有数据首先被划分为训练集和测试集，比例为80%和20%。在训练过程中，每种算法的超参数被调优以实现最佳的分类性能，该性能通过AUC、准确率、精确率、召回率和F1分数等五个指标进行评估。结果显示，随机森林算法在预测不同密度巨噬细胞群体方面表现出最佳的分类性能，其AUC接近84%，准确率和精确率分别达到79%和81%。相比之下，逻辑回归和K近邻算法在某些指标上也表现出较高的性能，但它们的准确率和精确率略低于随机森林。此外，研究还发现，当仅使用部分形态特征进行预测时，K近邻算法的表现优于其他算法，但使用所有形态特征时，随机森林和逻辑回归算法的性能更为突出。

研究还通过SHAP值分析了不同特征对分类结果的影响。SHAP值是一种解释机器学习模型预测结果的工具，能够量化每个特征对模型决策的贡献。结果显示，在预测低密度巨噬细胞群体时，平均半径和面积是最重要的两个特征，而在预测高密度巨噬细胞群体时，等效直径和中位半径则具有更高的贡献。这一发现表明，不同密度的巨噬细胞群体在形态特征上的变化具有一定的规律性，且某些特征可能更适用于特定密度的预测。

此外，研究人员还探讨了不同密度巨噬细胞群体的生物物理机制。他们提出，巨噬细胞在不同密度下的形态变化可能受到空间约束和细胞间相互作用的影响。例如，高密度的巨噬细胞群体由于细胞间接触更紧密，可能受到更强的空间限制，从而影响其大小，但对形状的影响较小。这种现象可能与细胞生长速率和分裂速率之间的脱节有关，即在空间受限的环境中，细胞可能通过减少体积来适应其周围环境。因此，巨噬细胞的大小变化可能是一种适应性机制，以应对不同密度下的空间约束。

本研究的结论表明，巨噬细胞的群体密度与其形态特征之间存在显著的关联，而某些形态特征可以作为预测群体密度的潜在指标。通过无标记的相位对比显微镜技术和机器学习方法，研究人员成功地揭示了不同密度巨噬细胞群体的形态差异，并识别了具有更高区分能力的特征。这些结果不仅加深了我们对巨噬细胞群体密度与形态特征之间关系的理解，也为未来研究提供了新的方向，即利用形态特征作为评估细胞群体密度的生物标志物。

尽管本研究取得了一定的成果，但其仍存在一些局限性。首先，研究中使用的RAW 264.7小鼠巨噬细胞系可能无法完全代表所有巨噬细胞类型，包括来源于其他物种的巨噬细胞系和原代巨噬细胞。因此，未来的研究可以扩展到其他类型的巨噬细胞，以验证本研究中发现的密度依赖性形态变化是否具有普遍性。此外，本研究是在体外单层培养条件下进行的，而实际的体内环境更为复杂，可能包含多种生物物理因素，如细胞外基质的刚度和流体剪切力等。因此，未来的研究可以考虑在更接近生理条件的模型中，如类器官、组织样和类器官模型中，进一步探讨巨噬细胞群体密度与形态特征之间的关系。

总的来说，本研究通过结合相位对比显微镜技术和机器学习方法，揭示了巨噬细胞群体密度与其形态特征之间的关系，并评估了不同形态特征在预测群体密度方面的潜力。这些发现不仅有助于理解巨噬细胞在不同密度下的行为和功能变化，也为未来研究提供了新的工具和方法，以更精确地评估细胞群体的特性。此外，研究还强调了在选择合适的算法和特征时，需要综合考虑多种因素，以实现最佳的预测性能。这些成果有望在生物医学研究和临床应用中发挥重要作用，特别是在细胞群体分析和疾病诊断方面。