PEDV和BVDV的共感染通过TLR7依赖的机制激活NF-κB通路

《Frontiers in Microbiology》：PEDV and BVDV coinfection activates the NF-κB pathway by a TLR7-dependent mechanism

猪流行性腹泻病毒与牛病毒性腹泻病毒共感染通过激活TLR7/NF-κB信号通路增强病毒复制及炎症反应。本研究采用体外细胞模型，发现BVDV预处理显著促进PEDV增殖，并揭示TLR7介导的NF-κB激活是这一协同效应的关键机制，同时证实TLR7抑制剂可抑制病毒复制和炎症因子表达。

　　近年来，猪腹泻性疾病已成为影响全球养猪业的重要公共卫生问题。其中，猪流行性腹泻病毒（PEDV）作为主要病原体之一，其感染常常伴随着其他肠道病原体的共同作用，导致病情更加复杂和严重。在临床实践中，研究人员观察到 PEDV 与其他腹泻相关病毒（如牛病毒性腹泻病毒 BVDV）的共感染现象非常普遍，且这种共感染模式可能加剧疾病的传播与致死率。为了深入理解病毒共感染对宿主免疫系统的影响，以及其如何促进病毒复制，我们设计了一系列实验，利用体外模型细胞 PK15 来研究 PEDV 与 BVDV 的共感染机制，并探讨 Toll 样受体（TLRs）在这一过程中的作用。

本研究中，我们首先对 PEDV 与 BVDV 的共感染模式进行了体外模拟。PK15 细胞是一种常用于研究猪病毒的模型细胞，因其能够被多种病毒有效感染。通过在细胞中先感染 BVDV，再感染 PEDV，我们发现 BVDV 的存在显著促进了 PEDV 的复制。这种促进作用在高 MOI（感染复数）的 BVDV 预感染条件下更为明显，具体表现为 PEDV 的病毒滴度在 36 和 48 小时后显著升高，且在高 MOI 的情况下，提升幅度更大。此外，通过 qRT-PCR 技术，我们检测了 PEDV N 基因的 mRNA 表达水平，发现其在共感染组中较单感染组有明显增加。这些结果表明，BVDV 的预感染可能为 PEDV 提供了一个更有利的复制环境，从而增强了其在细胞内的增殖能力。

为了进一步揭示这种共感染对宿主免疫反应的影响，我们使用免疫荧光分析（IFA）和 Western blot 技术检测了 NF-κB 通路中关键蛋白 p65 的核转位情况。NF-κB 是一种重要的转录因子，能够调控多种炎症因子的表达。研究发现，在 PEDV 与 BVDV 共感染的条件下，p65 的核转位比例显著高于单感染组，且在 24 小时后达到峰值。这一现象表明，共感染不仅促进了 PEDV 的复制，还显著激活了 NF-κB 通路，从而增强了宿主的炎症反应。此外，我们还发现，TLR7 在这一过程中发挥了关键作用。TLR7 是一种主要识别单链 RNA 的内吞体 Toll 样受体，其激活能够促进 NF-κB 的活化，并进一步引发炎症因子的大量产生。通过 siRNA 技术干扰 TLR7 的表达后，我们发现 NF-κB 活性被显著抑制，且炎症因子的表达水平也相应下降，这进一步支持了 TLR7 在 PEDV/BVDV 共感染诱导 NF-κB 激活中的核心地位。

在进一步的实验中，我们使用 TLR7 的特异性抑制剂 HCQ（羟氯喹）来验证 TLR7 通路是否直接参与 PEDV 的复制过程。结果显示，HCQ 的加入显著降低了 PEDV 的病毒滴度和 N 蛋白的表达水平，表明 TLR7 的激活在促进 PEDV 复制方面具有重要作用。同样地，在 TLR7 表达被抑制的细胞中，PEDV 的复制能力也明显减弱，进一步证明了 TLR7 通路在共感染条件下对病毒增殖的促进作用。这些结果表明，BVDV 与 PEDV 的共感染不仅通过激活 NF-κB 通路增强了宿主的免疫反应，还可能通过 TLR7 信号传导促进了病毒的复制，从而导致更严重的疾病表现。

此外，我们还对 TLR7 与其他 TLRs 的关系进行了分析。研究发现，在 PEDV 与 BVDV 共感染的情况下，TLR7 的表达水平显著上升，而其他 TLRs（如 TLR3、TLR8 和 TLR9）的表达变化并不明显。这表明 TLR7 在共感染过程中可能具有特异性的作用。进一步的 Western blot 分析显示，共感染不仅促进了 TLR7 的表达，还显著上调了 MyD88、IRAK4 和 TRAF6 等下游信号分子的表达水平。这些分子在 NF-κB 通路中起着重要的桥梁作用，其表达增强意味着共感染可能通过激活 TLR7/MyD88 信号轴，从而进一步放大 NF-κB 的激活效应。

在讨论部分，我们强调了 TLR7 在病毒共感染中的重要作用。TLR7 作为识别单链 RNA 的关键受体，其激活不仅有助于宿主对病毒的免疫应答，还可能在某些情况下促进病毒的复制。这种双重作用机制使得 TLR7 在病毒共感染中具有复杂的影响。一方面，它能够通过 NF-κB 通路诱导炎症因子的大量产生，从而增强宿主的免疫防御能力；另一方面，这种激活也可能为病毒提供一个更有利的复制环境，进而加剧疾病的严重性。例如，在 SARS-CoV-2 感染过程中，TLR7 和 TLR8 能够识别病毒的单链 RNA，而 TLR3 则在病毒 RNA 转化为双链 RNA 后发挥作用。这种 TLR 通路的协同激活可能导致过度的炎症反应，即“细胞因子风暴”，从而对宿主造成更大的伤害。

在 PEDV 与 BVDV 的共感染研究中，我们发现 TLR7 的激活不仅增强了 NF-κB 的活性，还通过促进炎症因子的表达，如 IL-6、IL-8、IL-18 和 TNF-α，进一步放大了宿主的免疫应答。然而，这种增强的免疫反应并未有效遏制病毒的复制，反而可能为病毒提供了更多的复制机会。这与之前的研究结果一致，即某些病毒共感染模式能够通过激活宿主的免疫系统，反而促进病毒的扩散和增殖。例如，有研究表明，某些病毒在共感染条件下能够利用宿主细胞的免疫反应来增加自身的复制效率，从而导致更严重的临床症状。

本研究的发现具有重要的实际意义。首先，它揭示了 PEDV 与 BVDV 共感染对宿主免疫系统的影响机制，为理解病毒共感染的复杂性提供了新的视角。其次，研究结果表明，TLR7 在共感染过程中可能是一个关键的调控节点，其激活不仅促进了 NF-κB 的活化，还可能通过增强炎症反应，间接影响病毒的复制能力。因此，针对 TLR7 通路的干预可能成为控制病毒共感染的新策略。此外，本研究还强调了 TLRs 在病毒感染中的双重角色，既能够作为宿主防御机制的一部分，也可能成为病毒利用的工具。这种复杂的相互作用机制提示我们，在研究病毒共感染时，不能简单地将宿主免疫反应视为单一的防御机制，而应更加关注其在病毒复制中的潜在促进作用。

总体来看，本研究通过体外实验揭示了 PEDV 与 BVDV 共感染对宿主免疫系统的影响，特别是 TLR7 在其中的关键作用。研究发现，BVDV 的预感染能够显著促进 PEDV 的复制，同时通过激活 TLR7/MyD88 信号通路增强 NF-κB 的活性，进而引发更强烈的炎症反应。然而，这种增强的免疫反应并未有效抑制病毒的复制，反而可能为病毒提供了更有利的环境。这些发现不仅有助于我们理解病毒共感染的分子机制，也为开发新的抗病毒策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索 TLR7 在不同病毒共感染中的普遍作用，以及如何通过调控这一通路来减轻病毒引起的免疫损伤和疾病严重性。