新鲜奶酪的体外胃肠道消化：ω-3脂肪酸及乳脂球膜改良对营养成分消化率及抗氧化活性的影响

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：In Vitro Gastrointestinal Digestion of Fresh Cheese: Effect of ω-3 Fatty Acids and Milk Fat Globule Membrane Enrichment on Nutrient Digestibility and Antioxidant Activity

本研究通过模拟胃肠消化评估了添加ω-3脂肪酸和MFGM膜浓缩物的超滤牛奶鲜奶酪的消化率及抗氧化活性，发现双富集处理（WM组）在保持蛋白质和脂质消化率的同时显著提升抗氧化能力，其机制与小分子肽数量及ω-3脂肪酸含量相关。

　　本研究旨在探讨从超滤乳（UFC）制成的新鲜奶酪在消化过程中的行为及其潜在生物活性，特别是添加ω-3多不饱和脂肪酸（FAs）和牛奶脂肪球膜浓缩物（MFGM）对奶酪性能的影响。通过模拟胃肠消化过程，依据标准化的INFOGEST协议，对四种UFC样本进行了评估，这些样本分别为：对照组（C）、ω-3 FAs富集组（W）、MFGM浓缩物富集组（M）以及同时富集ω-3 FAs和MFGM浓缩物的WM组。研究发现，无论是蛋白质还是脂质的消化率均未受到ω-3 FAs或MFGM浓缩物添加的负面影响，因为在胃肠消化后检测到了生物可利用的营养成分。其中，WM组表现出最高的抗氧化能力，这种能力与小分子肽的总数和ω-3 FAs含量密切相关。总体而言，添加ω-3 FAs和MFGM浓缩物所产生的奶酪在消化率上与对照组相似，但显著增强了其抗氧化能力。

奶酪作为一种复杂的蛋白质基质，提供了丰富的营养成分，包括具有健康和工艺价值的蛋白质和脂质。牛奶脂肪主要由含有甘油三酯（TGs）的脂肪球和由极性脂质（PLs）和蛋白质组成的三层膜构成。MFGM中的磷脂，如磷脂酰胆碱（PC），其功能被描述为具有抗癌、抗炎以及预防冠状动脉心脏病等作用。然而，饮食中的脂质生物活性成分并不直接被肠道上皮细胞吸收，而是需要经过脂解作用后，通过胆盐的乳化作用和混合微胶粒的形成才能被吸收。同样，牛奶蛋白质也需要被水解后才能在小肠中被吸收，而通常在原结构中被加密和失活的消化产物肽已被证实对人类健康有益。来自酪蛋白和乳清蛋白消化的肽已被描述具有多种生物活性，如抗高血压、抗凝血和抗氧化等。抗氧化活性尤为重要，因为它与其他生物效应相关，并且在功能食品和成分的生物活性潜力评估中被越来越多地用作初步指标。

生物活性成分在消化后能够被吸收，这一过程可以定义为食物在消化道中分解以获取生物可利用营养成分的生理过程。近年来，已为不同类型的食物基质开发并验证了生物可利用性检测方法，以评估营养成分和生物活性成分的释放。INFOGEST静态消化协议是生物可利用性研究中最广泛使用的方法，已被证明在大量食物基质中有效且适用。此外，该方法还展示了其对食物组成、加工和物理化学特性的适应性，不仅能够模拟生理条件，还能降低成本。这种方法已被用于研究多种食品产品的生物可利用性，从传统的未加工产品如牛奶、水果或肉类到工程化的功能性食品。

奶酪并非这类研究的例外，有显著的例子如Fang等人进行的奶酪消化研究，他们发现蛋白质和脂肪在消化结束时具有高度的生物可利用性。Asensio-Grau等人还研究了不同商业奶酪的消化情况，表明一些因素如基质特性、牛奶来源和成熟时间会影响脂解和蛋白质消化率。在新鲜奶酪消化方面，Castaneda和Lee研究了微结构和牛奶均质化对维生素D3生物可利用性的影响，发现随着蛋白质/脂肪比例和均质化压力的增加，维生素D3的生物可利用性会降低。Ribes等人则研究了口腔处理、吞咽特性及消化条件对蛋白质消化的影响，强调了口腔处理和新鲜奶酪基质分解程度对蛋白质消化的重要性。类似地，先前对低脂Akawi新鲜奶酪的消化研究也旨在确定生物可利用部分的生物活性。然而，仍需进一步研究以评估其他类型的新鲜奶酪基质对营养生物可利用性和生物活性的影响，尤其是在添加生物活性成分的情况下。

本研究旨在通过评估由超滤乳制成的新鲜奶酪的消化过程，并分析ω-3脂肪酸和MFGM浓缩物添加对蛋白质和脂质行为的影响，为该领域做出贡献。考虑到这些生物活性成分的已知健康益处，本研究还分析了对应消化产物的体外抗氧化活性，作为评估其潜在抗氧化能力的初步、标准化和可比性方法。

为了实现这一目标，本研究对新鲜奶酪进行了多种处理，包括蛋白质和脂质的分析。通过SDS-PAGE分析，可以了解蛋白质的消化情况，而通过HPLC-ELSD分析，可以研究脂质的类别。这些分析方法能够提供关于营养成分释放和生物活性的详细信息，有助于评估不同成分对奶酪性能的影响。此外，通过抗氧化活性检测，可以进一步评估这些成分在模拟消化条件下的潜在生物活性。

在研究过程中，首先对四种不同的UFC样本进行了评估，这些样本在两个主要变量上有所区别：牛奶脂肪酸组成和在生产过程中添加MFGM浓缩物。两种来自奶牛的牛奶（对照组和通过饲养方式自然富集ω-3 FAs的牛奶）由Feiraco Lácteos S.L.提供，并在试点工厂中使用10 kDa的OptimaFlow MAX Series膜进行超滤。MFGM浓缩物（Lacprodan，MFGM-10）被添加到超滤乳混合物中，以达到每60克奶酪样本含1克MFGM的水平。这些样本被命名为：C组（不含ω-3 FAs和MFGM的对照奶酪）、W组（不含MFGM的ω-3 FAs富集奶酪）、M组（不含ω-3 FAs的MFGM富集奶酪）以及WM组（同时富集ω-3 FAs和MFGM的奶酪）。所有奶酪均在半工业化的试点工厂中生产，并通过物理化学分析（干物质、总脂肪、脂质类别、脂肪酸组成、总蛋白和血清蛋白、NaCl和Ca2?）进行了表征，这些分析方法由Hueso等人详细描述。

在对蛋白质和脂质进行分析之前，首先需要进行体外消化实验。根据INFOGEST 2.0的静态消化协议，对UFC进行了模拟胃肠消化实验，该协议涵盖了人类消化的典型阶段：口腔、胃和肠道。此外，还应用了Viera和Kosmerl等人描述的修改方法。模拟消化液在实验前被提前制备并冷冻（?20 °C）保存，直到需要时再解冻。实验当天，溶液被解冻，并立即准备所需的酶和CaCl?：α-淀粉酶（A3176-猪胰腺，Sigma-Aldrich）、胃蛋白酶（P6887-猪胃粘膜，Sigma-Aldrich）、胆汁提取物（B8631-猪源，Sigma-Aldrich）和胰蛋白酶（P7545-猪胰腺，Sigma-Aldrich）。体外消化过程在三重复试验中进行，每种奶酪样本均进行三次重复。

在实验过程中，5克奶酪样本与模拟唾液液（SSF）混合，预热至37 °C，以获得10毫升的口腔消化液。SSF由电解质储备溶液、25 μL的0.3 M CaCl? × (H?O)?、750 μL的α-淀粉酶溶液（1,000 U/mL）和超纯水组成。最终溶液在摇动平台（VWR摇动平台，95 rpm）上于37 °C下孵育2分钟。对于胃消化阶段，向口腔消化液中加入8毫升预热的模拟胃液（SGF）、电解质储备溶液、5 μL的0.3 M CaCl? × (H?O)?以及足够的5 M HCl以将pH调整至3.0，随后加入667 μL的胃蛋白酶（60,000 U/mL）和超纯水以调整体积至20毫升。胃消化阶段在37 °C和95 rpm的条件下进行2小时。对于肠道消化阶段，向每个样本中加入8毫升预热的模拟肠液（SIF）、电解质储备溶液、3毫升胆盐溶液（10 mM）以及足够的5 M NaOH以将pH调整至7.0，孵育继续进行30分钟，以确保胆盐的溶解。随后加入40 μL的0.3 M CaCl? × (H?O)?、5毫升胰蛋白酶悬浮液和超纯水，以达到40毫升的最终体积。胰蛋白酶被加入SIF溶液中，以获得100 U/mL的最终胰蛋白酶活性。肠道消化阶段的孵育条件（2小时）与胃消化阶段保持一致。在完成体外消化的胃和肠道阶段后，将10毫升的样本转移到离心管中，并立即置于冰中以停止酶活性，如INFOGEST 2.0协议所述。随后，样本被保存在?20 °C，直到回收微胶粒，这一过程依据Corzo-Martínez等人的方法进行（4000 rpm，40分钟，20 °C）。在上清液（SN）和沉淀物（P）分离后，样本被保存在?20 °C，以备后续分析。

本研究的方法学局限性主要源于严格遵循INFOGEST协议。由于胃脂肪酶在低脂蛋白质基质中被认为不必要，因此在胃消化阶段省略了该酶的使用，这可能限制了可靠测定胃消化产物中脂质类别的能力。因此，后续的脂质分析主要集中在最终的胃肠消化产物上，以评估体外脂质消化的情况。

对于脂质的提取，采用了L?fgren等人的方法，并进行了适当调整。具体而言，200 μL的样本与1.6毫升甲醇和2.49毫升二氯甲烷混合，并使用旋转搅拌器（OVAN N12E，西班牙巴达隆纳）搅拌20分钟。随后加入1毫升20 mM的乙酸，混合并离心（3200 rpm，4 °C，5分钟），将底部有机相小心移除。上层甲醇相再次用二氯甲烷洗涤，移除并与之前的有机相合并。最后，总有机相通过装有无水硫酸钠和0.45 μm孔径的PVDF滤膜的注射器进行过滤。提取的脂质被收集在琥珀色瓶中，用氮气冲洗，称重并保存在?20 °C，直到分析。

脂质类别的分离通过HPLC系统（型号1260；Agilent Technologies Inc.）结合ELSD（SEDEX 85型号，Sedere SAS）进行，使用预先过滤的压缩空气作为雾化气体，压力为350 kPa，温度为60 °C；增益设置为3。使用两根串联的Zorbax Rx-SIL柱（250 × 4.5 mm，5 μm颗粒直径；Agilent Technologies Inc.）和一个具有相同填充的预柱。在分析前，样本被溶解在CH?Cl?中（5 mg/mL），并注入柱子后，在40 °C下平衡。溶剂梯度依据Castro-Gómez等人的方法进行。样本和标准品在相同的色谱条件下进行分析，所有分析均进行两次重复。

在对蛋白质进行分析时，采用了SDS-PAGE方法，对原始超滤乳、UFC以及对应的胃和胃肠消化产物（SN和P）进行了评估。电泳在Criterion Cell电泳槽（Bio-Rad）中进行，使用1× XTMES缓冲液，由50 mL的20× XTMES与950 mL的Milli-Q H?O混合而成。在还原条件下进行分析，使用β-巯基乙醇作为还原剂，方法参考了Paterson等人的描述。每个样本被稀释在样品缓冲液中，以达到0.8 mg/mL的最终蛋白质浓度。分子量标记使用的是Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio-Rad）。凝胶被用Bio-Safe Coomassie G-250染色，随后进行洗涤，以获得和分析图像，使用VersaDoc Imaging System凝胶阅读器和Image Lab版本6.1软件（Bio-Rad）。

在对肽的分子量分布进行分析时，采用了MALDI-TOF方法。首先，使用ZipTip C18 pipette tips（Merck Millipore）从胃和胃肠消化产物的SN中去除盐分并浓缩肽。随后，样本被稀释100倍在含有50%乙腈和0.1%三氟乙酸的溶液中，并在MALDI靶板上进行分析，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）作为之前描述的Santos-Hernández等人所述的方法。离子在正向线性模式下检测，使用Autoflex Speed进行，并从1000次平均激光射击的总和中收集。用于外部校准的肽和蛋白质校准标准（Protein Calibration Standard I，Bruker Daltonics）被采用。通过FlexAnalysis 3.3软件生成单同位素峰列表，并在去除肽对应的HCCA基质和消化空白后表示在分子量分布范围内。

在对抗氧化活性进行评估时，使用了ABTS和ORAC两种方法。ABTS（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）自由基清除活性通过Paterson等人的方法进行，该方法改编自Re等人的原始协议。简要地说，样本的连续稀释（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0 mg/mL）和Trolox标准曲线（25–200 μM）被制备。随后，将20 μL的PBS（空白）、Trolox和样本稀释液置于96孔透明微孔板中。180 μL的稀释ABTS自由基被加入每个孔中，混合并在室温下孵育7分钟，测量734 nm处的吸光度，使用Biotek Synergy HT板读数器（美国Winooski）。Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值在六次重复中测定，并以μmol Trolox等效（TEs）/g样本的形式表达。

ORAC（氧气自由基清除能力）检测则在每种胃和胃肠消化产物的SN上进行，依据Hernández-Ledesma等人的方法。反应在黑色96孔微孔板中进行，37 °C下在75 mM磷酸缓冲液（pH 7.4）中进行。每个孔中的最终检测混合液（200 μL）包含荧光素（117 nM）、2,2’-Azobis(2- amidinopropane) dihydrochloride（AAPH，14 mM）以及用于标准曲线的抗氧化剂（Trolox，0.2–1.6 nmol）或在磷酸缓冲液中稀释的样本（0.0312–1 mg/mL）。荧光在485和520 nm的激发和发射波长下每2分钟记录一次，持续120分钟，使用Fluostar Optima BMG Labtech板读数器，并由FLUOstar Control版本1.32 R2软件（德国Ortenberg）控制。ORAC值在四次重复中测定，并以μmol TE/g样本的形式表达。

对结果进行统计分析时，使用了ANOVA方法，并通过Fisher的最小显著性差异测试，使用XLSTAT Premium软件（Addinsoft，巴黎，法国）进行。差异在p < 0.05时被认为是统计学上显著的。

UFC在体外消化前的总体组成如表1所示。所有奶酪样本的总脂肪含量相似，而W和WM奶酪中的ω-3脂肪酸含量是C和M奶酪的两倍。M和WM奶酪中的极性脂质含量增加了四倍，这归因于MFGM浓缩物的加入。M和WM奶酪还显示出轻微的总蛋白含量增加。然而，血清蛋白含量没有显著差异，表明MFGM的加入并未增加UFC中的乳清蛋白含量。

在对UFC的脂质消化进行研究时，所有奶酪样本的脂肪含量在5.1%至5.3%之间。根据INFOGEST 2.0协议和Viera等人的研究，该协议在不同低脂和高脂基质中研究脂质消化，因此在胃消化阶段省略了胃脂肪酶。这一决定基于UFC是低脂、高蛋白基质，胃脂肪酶的加入被认为是不必要的。然而，为了更好地模拟体内条件并克服本研究的局限性，未来的模拟胃肠脂质消化模型也应评估胃脂肪酶的加入。

脂质提取在未消化的UFC和胃肠消化产物的上清液中进行，以获得脂质成分的分布信息。表2显示了这些未消化和消化样本的脂质类别。在未消化的UFC中，TG是主要的脂质类别，占总脂质含量的88%至93%。在未消化样本中，极性脂质含量有显著差异。M和WM奶酪（0.36 ± 0.01 g/100 g和0.39 ± 0.03 g/100 g）的极性脂质含量是未富集的对照样本（C和W）的4.5倍以上。此外，M和WM奶酪还显示出总蛋白含量的轻微增加。然而，血清蛋白含量没有显著差异，表明MFGM的加入并未增加UFC中的乳清蛋白含量。

在对蛋白质进行分析时，使用了SDS-PAGE方法，对原始超滤乳、UFC以及对应的胃和胃肠消化产物（SN和P）进行了评估。电泳在Criterion Cell电泳槽中进行，使用1× XTMES缓冲液，由50 mL的20× XTMES与950 mL的Milli-Q H?O混合而成。在还原条件下进行分析，使用β-巯基乙醇作为还原剂，方法参考了Paterson等人的描述。每个样本被稀释在样品缓冲液中，以达到0.8 mg/mL的最终蛋白质浓度。分子量标记使用的是Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio-Rad）。凝胶被用Bio-Safe Coomassie G-250染色，随后进行洗涤，以获得和分析图像，使用VersaDoc Imaging System凝胶阅读器和Image Lab版本6.1软件（Bio-Rad）。

在对肽的分子量分布进行分析时，使用了MALDI-TOF方法。首先，使用ZipTip C18 pipette tips（Merck Millipore）从胃和胃肠消化产物的SN中去除盐分并浓缩肽。随后，样本被稀释100倍在含有50%乙腈和0.1%三氟乙酸的溶液中，并在MALDI靶板上进行分析，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）作为之前描述的Santos-Hernández等人所述的方法。离子在正向线性模式下检测，使用Autoflex Speed进行，并从1000次平均激光射击的总和中收集。用于外部校准的肽和蛋白质校准标准（Protein Calibration Standard I，Bruker Daltonics）被采用。通过FlexAnalysis 3.3软件生成单同位素峰列表，并在去除肽对应的HCCA基质和消化空白后表示在分子量分布范围内。

在对蛋白质进行分析时，采用了SDS-PAGE方法，对原始超滤乳、UFC以及对应的胃和胃肠消化产物（SN和P）进行了评估。电泳在Criterion Cell电泳槽中进行，使用1× XTMES缓冲液，由50 mL的20× XTMES与950 mL的Milli-Q H?O混合而成。在还原条件下进行分析，使用β-巯基乙醇作为还原剂，方法参考了Paterson等人的描述。每个样本被稀释在样品缓冲液中，以达到0.8 mg/mL的最终蛋白质浓度。分子量标记使用的是Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio-Rad）。凝胶被用Bio-Safe Coomassie G-250染色，随后进行洗涤，以获得和分析图像，使用VersaDoc Imaging System凝胶阅读器和Image Lab版本6.1软件（Bio-Rad）。

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在对蛋白质进行分析时，采用了SDS-PAGE方法，对原始超滤乳、UFC以及对应的胃和胃肠消化产物（SN和P）进行了评估。电泳在Criterion Cell电泳槽中进行，使用1× XTMES缓冲液，由50 mL的20× XTMES与950 mL的Milli-Q H?O混合而成。在还原条件下进行分析，使用β-巯基乙醇作为还原剂，方法参考了Paterson等人的描述。每个样本被稀释在样品缓冲液中，以达到0.8 mg/mL的最终蛋白质浓度。分子量标记使用的是Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio-Rad）。凝胶被用Bio-Safe Coomassie G-250染色，随后进行洗涤，以获得和分析图像，使用VersaDoc Imaging System凝胶阅读器和Image Lab版本6.1软件（Bio-Rad）。

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在对蛋白质进行分析时，采用了SDS-PAGE方法，对原始超滤乳、UFC以及对应的胃和胃肠消化产物（SN和P）进行了评估。电泳在Criterion Cell电泳槽中进行，使用1× XTMES缓冲液，由50 mL的20× XTMES与950 mL的Milli-Q H?O混合而成。在还原条件下进行分析，使用β-巯基乙醇作为还原剂，方法参考了Paterson等人的描述。每个样本被稀释在样品缓冲液中，以达到0.8 mg/mL的最终蛋白质浓度。分子量标记使用的是Precision Plus Protein Dual Xtra Prestained Protein Standards（Bio-Rad）。凝胶被用Bio-Safe Coomassie G-250染色，随后进行洗涤，以获得和分析图像，使用VersaDoc Imaging System凝胶阅读器和Image Lab版本6.1软件（Bio-Rad）。

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