通过m6A RNA调控缺陷致不育分析探索地中海涡虫作为生殖毒性模型的潜力

《Current Research in Toxicology》：Exploring the potential of Schmidtea mediterranea as a model for reproductive toxicity through analysis of sterility caused defective m6A RNA regulation

本研究针对生殖毒性评估中哺乳动物模型存在的伦理和成本问题，以地中海涡虫为对象，系统探究了m6A RNA甲基化调控机制在生殖细胞发育中的关键作用。研究人员发现METTL3/METTL14甲基转移酶复合体及其阅读蛋白YTHDF同源物在涡虫卵巢和睾丸中特异性表达，通过RNA干扰技术证实其功能缺失会导致配子发生障碍。该研究首次在扁形动物中揭示了m6A调控通路在生殖细胞分化中的保守功能，为开发新型生殖毒性筛选模型提供了重要理论依据。

　　

在毒理学研究领域，生殖毒性评估一直面临重大挑战。传统的发育和生殖毒性（DART）测试主要依赖哺乳动物模型，这些模型不仅存在伦理争议，而且成本高昂、通量有限，难以进行机制层面的深入解析。随着欧盟REACH法规和经济合作与发展组织（OECD）测试指南等监管框架的推进，开发能够替代或补充传统动物测试的新方法已成为迫切需求。其中，将RNA修饰等分子生物标志物整合到非哺乳动物模型中，为揭示保守的发育过程提供了新思路。

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）作为真核生物RNA中最常见的转录后修饰之一，在哺乳动物配子发生过程中发挥着关键作用。虽然此前已有研究在涡虫体细胞中发现了m⁶A RNA调控的存在，但该调控通路在这些或其他冠轮动物生殖系中的存在及其生物学意义仍属未知。为此，研究团队选择地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）这一模式生物，系统研究了m⁶A RNA调控因子在其生殖系发育中的功能。这项研究发表于《Current Research in Toxicology》，为生殖毒性评估提供了新的视角和方法。

研究团队采用了一系列关键技术方法：通过TBLASTN比对鉴定了涡虫中m⁶A通路同源基因；利用整体原位杂交（WMISH）和荧光原位杂交（FISH）技术分析了基因表达模式；采用RNA干扰（RNAi）技术进行基因功能缺失研究；通过点印迹分析检测m⁶A丰度变化；使用RT-qPCR评估基因表达水平；并利用DAPI染色和共聚焦显微镜观察生殖腺发育情况。

m⁶A RNA甲基化写入器和阅读器基因同源物在地中海涡虫脑部和生殖腺中表达

研究人员首先通过生物信息学分析，在地中海涡虫中鉴定出了METTL3、METTL14、WTAP等m⁶A甲基化通路关键组分的同源基因，以及YTHDF1和YTHDF2阅读蛋白的同源物，但未发现ALKBH5和FTO去甲基化酶的同源物。表达分析显示，Smed-METTL3、Smed-METTL14、Smed-WTAP等基因在无性系涡虫的脑部特异性表达，而在有性系涡虫中，这些基因同时在卵巢和睾丸中表达。通过X射线照射去除干细胞后，METTL3和METTL14的表达并未显著变化，表明它们主要表达于分化细胞而非干细胞。

Smed-METTL3和Smed-METTL14在涡虫卵巢生殖系干细胞和卵母细胞中共表达

高分辨率荧光原位杂交分析揭示，Smed-METTL3和Smed-METTL14在涡虫卵巢的生殖系干细胞和成熟卵母细胞中共同表达，且表达模式高度重叠。这一发现支持了METTL3/METTL14异源二聚体在涡虫中形成功能性甲基转移酶复合体的假说，与哺乳动物中的机制相似。

m⁶A RNA调控有助于地中海涡虫雌雄生殖腺的正常发育

RNA干扰实验表明，敲低Smed-METTL3或Smed-METTL14会导致涡虫生殖腺发育异常，表现为卵巢缺乏卵母细胞、睾丸缺乏精子。同时敲低两个基因会使表型外显率显著提高，卵巢和睾丸发育缺陷分别达到85%和71%。点印迹分析证实，RNA干扰处理后涡虫整体m⁶A丰度明显下降，表明m⁶A RNA甲基化调控是涡虫生殖腺正常发育的必要条件。

m⁶A RNA写入器和阅读器支持地中海涡虫雌雄生殖系发育的正常进程

进一步的功能分析发现，虽然m⁶A调控因子的敲低不影响生殖系干细胞的维持，但会特异性破坏配子发生过程。Smed-YTHDF1-2的敲低导致卵子发生缺陷，而Smed-YTHDF2-3和Smed-YTHDF2-2的敲低则影响精子发生。当读者基因与写入器基因同时敲低时，生殖缺陷表型的外显率进一步提高。值得注意的是，即使在配子完全缺失的样本中，早期生殖细胞标记物gH4仍能检测到表达，表明m⁶A调控主要影响生殖细胞的分化进程而非干细胞的维持。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次在地中海涡虫有性生殖个体中证实了m⁶A RNA修饰及其调控因子的存在，并揭示了该通路在生殖细胞发育中的关键作用。与果蝇、斑马鱼和小鼠中的研究结果一致，这表明m⁶A调控在配子发生中的功能在双侧对称动物中具有进化保守性。

一个有趣的发现是，涡虫中似乎缺乏m⁶A去甲基化酶同源物，表明m⁶A修饰在该物种中可能不是可逆过程。这种特性可能与涡虫持续的细胞更新和可塑性调节有关，其中细胞分化决策可能是不可逆的。

从毒理学应用角度看，该研究为将涡虫模型用于生殖毒性评估提供了分子基础。m⁶A丰度和配子发育状况可作为机制性终点，用于替代生殖毒性测试的早期筛选。与秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇等其他小型模式生物相比，涡虫作为同时雌雄同体生物，能够在同一生理条件下观察雌雄配子发生，为研究生殖完整性保护的保守分子机制提供了独特优势。

然而，研究也存在一定局限性，如功能分析仅限于部分预测的m⁶A调控因子，尚未进行转录组范围的图谱分析以识别特异性mRNA靶标。此外，外源化学物质暴露对涡虫m⁶A动态的影响仍有待测试。未来研究应整合全局m⁶A分析和毒物暴露实验，评估m⁶A变化是否与生殖毒性结果相关，从而确立RNA修饰模式作为可靠的机制性终点。

总体而言，这项研究不仅阐明了m⁶A通路在涡虫生殖细胞发育中的生物学意义，还为将该模型系统用于生殖毒性研究奠定了分子基础。在整合化学安全评估策略中，涡虫模型可作为DART评估早期筛选阶段的成本效益高、通量大的系统，补充哺乳动物测试，支持3R原则（替代、减少、优化）。虽然涡虫传统上用于生态毒理学研究，但其与哺乳动物在RNA修饰和生殖系完整性通路上的分子保守性，支持了其转化相关性。类似于Ames测试使用细菌检测致突变潜力，涡虫系统展示了简单非哺乳动物系统如何为早期危害识别提供机制见解。