乙酸酯共培养强化解脂耶氏酵母对乙二醇的生物转化及乙醇酸合成

《Bioresource Technology》：Acetate co-feeding increases ethylene glycol assimilation and glycolic acid production in Yarrowia lipolytica

本研究针对塑料废弃物升级回收的挑战，聚焦于利用解脂耶氏酵母将PET解聚单体乙二醇（EG）生物转化为高值化学品乙醇酸（GA）。研究人员通过乙酸酯（Ac）与EG共培养策略，显著提升了EG同化效率和GA产量（达48.4 g/L，摩尔产率73%），并结合13C标记实验、代谢通量分析和转录组学，首次揭示了EG碳骨架通过乙醛酸循环及甘氨酸/丝氨酸途径整合入酵母生物量的代谢机制，为塑料废弃物的微生物升级回收提供了新思路。

　　

随着全球塑料产量的持续增长（2022年达4.003亿吨），聚乙烯 terephthalate（PET）作为年产量约6100万吨的主要聚酯，其废弃物处理已成为严峻的环境挑战。传统机械回收往往导致材料性能下降，而化学回收虽能解聚为单体，却依赖高能耗工艺。在此背景下，生物回收（biorecycling）利用酶将PET解聚为对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG），再通过微生物转化将这两种单体“升级循环”（upcycling）为高值化学品，成为实现塑料循环经济的关键路径。

乙醇酸（glycolic acid, GA）作为最小的α-羟基酸，在纺织、食品、制药等领域应用广泛，全球市场规模达3.024亿美元（2023年）。然而，其化学合成法依赖石油原料，反应条件苛刻且选择性低。生物合成路线则展现出巨大潜力，尤其是利用微生物将EG氧化为GA。非传统酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）因其广泛的底物利用能力及工业适用性备受关注，但该酵母在最小培养基中无法以EG为唯一碳源生长，限制了其在该领域的应用。

为解决这一瓶颈，意大利巴里大学的研究团队在《Bioresource Technology》发表论文，创新性地提出乙酸酯（acetate, Ac）与EG共培养策略。乙酸酯作为一种可再生、低成本的碳源（价格350-450美元/吨），可通过有机废物厌氧消化等可持续方式获取。研究通过¹³C标记实验、代谢通量分析（¹³C-MFA）、转录组学及生物反应器发酵等多技术联用，系统阐明了共培养条件下EG的代谢命运及其对GA合成的促进作用。

关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9系统构建YlAGX1基因敲除菌株；通过¹³C标记底物（1,2-¹³C₂-EG和1,2-¹³C₂-Ac）结合气相色谱-质谱（GC-MS）分析碳流向；基于INCA软件进行¹³C代谢通量分析以量化代谢网络流量；采用RNA-seq技术比较乙酸酯单独培养与共培养条件下的基因表达差异；在5升生物反应器中优化脉冲补料策略以提升GA产量。

3.1. 乙酸酯刺激解脂耶氏酵母对EG的利用

研究发现，EG作为唯一碳源时，Y. lipolytica无法生长，但可缓慢氧化EG生成少量GA（2.3-3.1 g/L）。当与20 g/L乙酸酯共培养时，EG消耗速率提升11倍至0.11 g/(L·h)，最终生物量（DCW）达5.0 g/L，GA产量提高至19.7 g/L（摩尔产率0.91 mol/mol）。相比之下，葡萄糖与EG共培养因培养基酸化（pH降至2.5）导致GA产量（6.1 g/L）和转化率显著降低。乙酸酯的加入不仅缓解了单独使用乙酸酯时培养基碱化（pH升至11.6）对生长的抑制，还协同促进了EG的代谢。

3.2. 通过¹³C标记实验和代谢通量分析追踪EG去向

¹³C标记实验表明，GA几乎完全来源于EG。更重要的是，EG碳标记广泛出现在蛋白质氨基酸中，尤其在甘氨酸和丝氨酸中贡献了近50%的碳骨架。敲除乙醛酸:丙氨酸氨基转移酶基因（YlAGX1）后，EG对甘氨酸/丝氨酸合成的贡献降低约50%，证实该酶在EG同化中的关键作用。¹³C-MFA进一步量化了代谢通量：约7%的EG碳通过乙醛酸循环（5%）和甘氨酸/丝氨酸合成（2%）进入中心代谢，其余则转化为GA。模型提示EG氧化可能生成NADPH，从而减少细胞对磷酸戊糖途径（PPP）的依赖。

3.3. 基于转录组学的EG和乙酸酯共利用分析

转录组分析显示，与单独乙酸酯培养相比，共培养条件下有2108个基因显著上调。基因集富集分析（GSEA）突出显示了氧化还原酶活性（尤其是作用于醛/酮基团并以NAD(P)⁺为受体的酶）、甲酸脱氢酶、酒精脱氢酶（如YlADH1）和醛脱氢酶基因的上调。同时，谷胱甘肽还原酶和锰超氧化物歧化酶等抗氧化相关基因也被诱导，表明EG氧化可能引发氧化应激反应。

3.4. 生物反应器中Y. lipolytica生产GA

在5升生物反应器中比较两种补料策略：策略一（高起始Ac+脉冲EG）最终产GA 17.4 g/L，产率0.99 mol/mol；策略二（高起始EG+脉冲Ac）效果更优，在66小时内产GA达48.4 ± 1.4 g/L，摩尔产率73%，生产率0.73 g/(L·h)，创下酵母一步发酵法生产GA的最高纪录之一。

研究结论强调，乙酸酯共培养通过提供乙酰辅酶A（acetyl-CoA）激活乙醛酸循环，使EG衍生的乙醛酸得以同化为C₄中间体，支持生物量合成。同时，EG氧化可能贡献NADPH，改善乙酸酯代谢的能量瓶颈。该研究首次直接证明了塑料衍生单体（EG）能够整合入酵母生物量，并成功将EG高效转化为GA。所开发的基于最小培养基的共培养工艺，相比传统的丰富培养基策略，更具经济性和可持续性。这项工作为利用Y. lipolytica平台进行PET废弃物升级回收提供了坚实的代谢基础和工艺蓝图，推动了循环生物经济的发展。