毛滴虫分枝杆菌噬菌体Mao1的基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequence of Mycobacterium smegmatis phage Mao1

噬菌体Mao1基因组分析显示其含65240bp，101个基因，GC含量66.3%，与Sejanus同属AD簇且序列相似度达99.79%，但ORF3因单碱插入产生 frameshift，基因组呈现前半同源后半镶嵌特征。电子显微镜测得尾和capsid尺寸分别为278.974nm和67.603nm，通过Phage Hunting实验从佐治亚大学北校区土壤中分离并测序。

　　

摘要

在北乔治亚州分离出的一种温和型噬菌体Mao1的基因组包含65,240个碱基对，共有101个已确认的基因，不含tRNA基因，其鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）含量为66.3%。该噬菌体与Sejanus噬菌体的核苷酸同源性达到99.79%。核苷酸同源性超过50%的噬菌体会被归类为不同的簇，而Mao1属于AD簇。

公告

噬菌体可以通过噬菌体疗法来对抗抗生素耐药性（1）。为此，需要研究噬菌体的开发和多样性。本文通过介绍Mao1噬菌体来增进人们对这类噬菌体的认识，Mao1属于AD簇，能够感染Mycobacteria smegmatis mc²155菌株。

Mao1是从位于乔治亚州达洛内加（Dahlonega）的北乔治亚大学（坐标：34.527776 N, 83.986272 E）的富集土壤中分离出来的，这种土壤为干燥的沙质土壤。噬菌体的分离采用了Science Education Alliance-Phage Hunting Advancing Genomics and Science提供的方法（2）。具体步骤包括：向土壤样本中加入7H10液体培养基，在37°C下培养24小时，然后用0.22 μm过滤器进行过滤。过滤后的液体在37°C下与Mycobacteria smegmatis mc²155菌株共同培养并再次过滤。当通过传统方法检测到噬菌斑后，进行三轮纯化处理，最终提取基因组DNA用于测序。使用磷钨酸染色技术通过电子显微镜观察了Mao1的形态，发现其具有尾状结构，衣壳和尾部的长度分别为约67.603纳米和278.974纳米（图1A）。Mao1形成的噬菌斑直径约为3毫米，边缘呈明显的圆形（3）（图1B）。

图1

图1 （A）Mao1的透射电子显微镜（TEM）图像，由乔治亚大学电子显微镜实验室使用JEM-1011 TEM（JEOL公司，日本东京）拍摄。（B）稀释比例为10^?5的Mao1样本在37°C下培养48小时后的结果。

噬菌体的基因组DNA是从裂解产物中提取的，按照制造商提供的Wizard DNA Extraction Kit（Promega）试剂盒的步骤进行制备。使用NEB Ultra II Library Kit 9（含v3试剂）和150个碱基长的读段构建了基因文库。Mao1的基因组中G-C含量为66.3%，长度为65,240个碱基对，末端为环状排列。从文库中获得了325,500个单端读段，这些读段使用Newbler v2.9软件和默认参数进行组装。使用Consed v2.9软件对组装后的单噬菌体 contig进行了完整性、准确性及基因组末端的检测（4）。

Mao1的基因组注释使用了多种工具，包括Glimmer v3.02（5）、GeneMark v2.5p（6）、DNA Master v4.2.1.11、Phamerator v557（7）、Starterator v557、NCBI BLASTp v2.15.0（8）、HHPred v2.08（9）、TMHMM v.1.0.24（9）和PECAAN v20240320（10）。所有软件均使用默认参数运行。E值小于或等于10^e?10的匹配结果被视为有效。Phamerator和GeneMark分析显示Mao1含有101个开放阅读框（ORFs），其中36个具有功能注释。基因1–38、49–90、93–95和97–99在正向链上有读段，而基因39–48、91–92、96和100–101在反向链上有读段。根据预测，Mao1属于温和型噬菌体，因为其基因组中存在酪氨酸整合酶（ORF43）。Mao1与Sejanus噬菌体（GenBank登录号OP172873）的核苷酸同源性高达99.79%（通过BLAST比对得出）。值得注意的是，ORF3区域存在一个碱基对插入，导致移码现象，形成了一个较长的ORF，而非其他簇成员所见的两个ORF。Mao1 ORF3的后半部分与Sejanus的ORF4完全一致，而前半部分与Sejanus的ORF3也有较高程度的同源性（通过BLASTp比对）。Mao1基因组的前半部分与其簇成员具有同源性，而后半部分则失去了大部分同源性，这体现了噬菌体基因组的镶嵌特性（11）。

致谢

发现并分离该噬菌体的实验室隶属于Science Education Alliance-Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science（SEA-PHAGES）项目，该项目得到了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的支持。

Christina Miller和Audrey Nesbit协助完成了多项实验步骤，最终将DNA样本送交测序。

在UGA乔治亚电子显微镜设施工作的Mary Ard通过透射电子显微镜帮助找到了该噬菌体，并协助进行了图像分析。

UNG荣誉计划为该项目提供了资金支持。SEA-PHAGES实验室提供了用于分离噬菌体的实验方案。匹兹堡大学也参与了噬菌体的测序工作并将基因组数据返回。