来自巴西潘塔纳尔高盐湖泊的两株嗜碱微小杆菌（Exiguobacterium alkaliphilum）的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of two Exiguobacterium alkaliphilum isolates from the Brazilian Pantanal hypersaline lakes

气候危机促使极端微生物用于污染物降解研究，巴西潘塔纳尔高盐碱性湖分离出两种Exiguobacterium alkaliphilum菌株（BS282和BS283），完成基因组测序及生物降解能力分析，发现其具有烷烃、芳香族化合物和塑料降解潜力。

　　在当前全球气候危机日益加剧的背景下，寻找替代性的解决方案成为应对气候变化和环境污染的重要研究方向。极端环境微生物因其独特的生存能力，展现出了巨大的潜力，尤其是在污染物的降解与去除方面。本研究通过基因组测序技术，获得了两种来自巴西潘塔纳尔地区超盐碱湖的 *Exiguobacterium alkaliphilum* 分离株，并深入探讨了它们在生物修复中的应用前景。

这两种分离株来源于巴西潘塔纳尔地区 *Pantanal Nhecolandia* 的沉积物样本，该地区以极端环境条件著称，包括高盐度和高碱度的湖水环境。为了获得这些分离株，研究人员首先去除了沉积物的表层，然后使用塑料管在4°C条件下保存了底层的样本。在分离过程中，采用了含盐的培养基（酵母提取物10克/升，NaCl 100克/升，C6H5Na3O7 3克/升，KCl 2克/升，MgSO4 1克/升，MnCl2 280微克/升，FeSO4 0.05克/升，以及NaHCO3 3克/升），以模拟其自然生存环境。为了确保分离株的纯度，研究人员进行了多次亚培养，并通过革兰氏染色验证了分离过程的准确性，以排除可能的污染。

在基因组测序方面，采用了长读长和短读长的联合策略。对于长读长测序，研究人员使用了Nanopore技术，构建了DNA文库，并使用PromethION R10设备进行测序。文库构建过程中，采用了Ligation Sequencing gDNA Native Barcoding Kit 96 V14试剂盒，以提高测序的准确性和覆盖度。测序数据的处理和分析使用了Dorado v 1.0.2进行碱基调用，同时结合了短读长测序数据，以提高基因组组装的完整性。短读长测序则使用了Illumina NextSeq 1000平台，结合了2 × 300 bp的测序模式和P1-600 Illumina试剂盒，以获得高质量的基因组信息。

为了确保测序数据的质量，研究人员使用了FastQC v0.11.9和fastp v0.23.4进行过滤，去除了低质量的序列，并通过参数设置（如去除poly-G序列、检测接头序列、最小长度设置为90 bp）提高了数据的可靠性。对于长读长数据，使用了Filtlong v0.2.1进行修剪，同时结合了短读长数据作为k-mer匹配，以进一步优化基因组组装。基因组的组装采用了多种工具，包括Trycycler v0.5.5、Flye v2.9.5-b1801、Minipolish和Raven v1.8.3，以确保组装结果的准确性。其中，Flye v2.9.5-b1801使用了‘--nano-hq’参数，以提高对高质量长读长数据的处理能力。Raven v1.8.3则采用了‘--disable-checkpoints’和‘--graphical-fragment-assembly’参数，以优化基因组的拼接过程。

在基因组的最终处理阶段，研究人员使用了Bandage v0.8.1对基因组进行人工校对，并移除了不完整的组装结果。为了进一步提高基因组的准确性，采用了Medaka v2.0.1进行共识读长的校正，并使用Polypolish v0.6.0和Pypolca v0.3.1进行短读长校正。其中，Pypolca v0.3.1使用了‘—careful’参数，以确保校正过程的细致性。此外，研究人员还使用了Plassembler v1.6.2对质粒的存在进行了评估，以确定这些分离株是否携带额外的遗传元件。

在基因组的完整性评估方面，使用了BUSCO工具v5.8.2，该工具能够根据参考数据库中的基因预测，评估基因组的完整性。结果表明，这两种分离株的基因组完整性达到了较高的水平，其中BS282和BS283的基因组完整性分别为99.2%。这一结果为后续的功能注释和分析提供了坚实的基础。为了进一步完善基因组的注释，研究人员使用了PROKKA v1.14.6和PGAP v2024-07-18.build7555注释流程，对基因组中的功能基因类别进行了分类，包括代谢、信号传导和信息处理等。通过这些工具，研究人员能够准确地识别基因组中的编码序列（CDS）、非编码RNA（ncRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）等基因类型，并进一步分析其功能特性。

基因组的组装和注释结果显示，这两种分离株具有高度相似的基因组结构，基因组大小约为2.86 Mb，GC含量为53.47%。此外，基因组中包含一个完整的染色体和多个质粒，其中质粒的长度分别为1,840 bp和5,865 bp。质粒的覆盖深度在不同测序平台之间存在差异，其中Nanopore测序的覆盖深度分别为760和75，而Illumina测序的覆盖深度分别为1,233和669。质粒的拷贝数分别为2.23和0.9，表明这些质粒在基因组中可能具有不同的复制机制和功能特性。

通过进一步的功能分析，研究人员使用了HADEG工具v231119，对这两种分离株的代谢能力进行了评估。结果表明，这两种分离株具有降解烷烃、甲苯和PLA塑料的能力，其中涉及的关键基因包括A_Alkanes（如AeAB_ahpC和AeAB_ahpF）、C_Aromatics（如AeCZGII_pchA）和E_Plastics（如AeEP_SUBS_LEDLE）。这些基因的发现为后续研究这些微生物在生物修复中的应用提供了重要的线索。

在基因组的结构和功能分析方面，研究人员还使用了QUAST v5.2.0进行组装质量评估。结果表明，这两种分离株的基因组组装质量较高，能够准确地反映其基因组的结构和功能特性。此外，研究人员还对基因组中的伪基因进行了分析，发现伪基因的数量分别为14和14，其中部分伪基因存在多种问题，如框架移位、不完整编码和多重问题。这些伪基因的存在可能影响基因组的功能特性，但总体而言，基因组的完整性较高，能够提供较为准确的功能注释。

通过这些研究，研究人员不仅获得了两种 *Exiguobacterium alkaliphilum* 分离株的完整基因组信息，还揭示了它们在生物修复中的潜在应用。这些微生物能够降解多种有机污染物，包括烷烃、甲苯和PLA塑料，这表明它们在环境治理中具有重要的应用价值。此外，研究人员还发现这些分离株能够合成生物表面活性剂，这可能有助于提高污染物的生物可降解性。

总的来说，这项研究为极端环境微生物在生物修复中的应用提供了重要的基础。通过基因组测序和功能分析，研究人员不仅揭示了这些微生物的遗传特性，还评估了它们在环境治理中的潜力。这些结果为未来的生物修复技术开发提供了重要的参考，并可能推动更多关于极端环境微生物的研究。随着对这些微生物的深入研究，有望开发出更加高效和可持续的生物修复方法，以应对日益严重的环境污染问题。