从坦桑尼亚的家猪中分离出的两种基因型II非洲猪瘟病毒的近乎完整的基因组

《Microbiology Resource Announcements》：Near-complete genome of two genotype II African swine fever viruses recovered from domestic pigs in Tanzania

非洲猪瘟病毒II型毒株基因组测序及遗传分析发现坦桑尼亚Mbozi地区2017年分离的两个近完整基因组通过tiled amplicon Oxford nanopore测序获得，与全球已知II型毒株亲缘关系密切，基因组存在多处插入/缺失突变及末端重复区缺失。

　　

摘要

2017年，在坦桑尼亚姆博兹地区从家猪中分离出两种接近完整的II型非洲猪瘟病毒（ASFV）基因组，采用 tiled amplicon Oxford nanopore测序技术进行测序。本研究描述的这两种ASFV基因组与其他全球报道的II型分离株具有密切关系。

公告

非洲猪瘟（ASF）是一种跨境动物疾病，致死率可达100%（1）。对ASF病毒（ASFV）进行全基因组测序有助于制定控制策略。ASFV是一种有包膜的双链DNA病毒，属于Asfarviridae科、Asfivirus属（2）。为克服ASFV测序中的挑战（包括宿主DNA的干扰），研究人员开发了tiled amplicon测序方法（3, 4）。

在2017年坦桑尼亚南部姆博兹地区ASF疫情期间收集的组织样本（包括脾脏和肠系膜淋巴结，样本编号为ASFV/TAN/17/Mbozi/1和ASFV/TAN/17/Mbozi/2）经过检测后被归类为II型ASFV（5）。DNA提取使用QIAamp DNA纯化试剂盒（Qiagen，德国希尔德恩），随后按照先前描述的方法进行聚合酶链反应（PCR）扩增（3）。共使用32对tiled引物对，通过PCR Bio VeriFi Hot Start高保真DNA聚合酶扩增约7 kb的片段，相邻扩增子之间有1 kb的重叠区域。扩增子大小通过1%琼脂糖凝胶电泳验证（Gel DocTM EZ Imager，Bio-Rad，美国赫拉克勒斯）。扩增子被汇集用于文库制备，使用ligation sequencing试剂盒（SQK-LSK109，Oxford Nanopore Technologies，英国牛津），并在R9.4.1流式细胞仪上使用MinION MK1c进行测序，碱基 calling和多路复用分析由Guppy v5.0.14软件（Oxford Nanopore Technologies，英国牛津）完成。数据分析采用Lilo流程（https://github.com/amandawarr/Lilo）：该流程利用参考序列通过bedtools v2.30.0对扩增子进行排序和分离，根据最高质量的读段进行优化处理，同时使用Porechop v0.2.3去除引物序列，最后使用Scaffold_builder v2.3进行基因组组装。由于测序数据中存在嵌合扩增子导致的组装问题，对Lilo流程进行了修改：在“assign”规则中调整了bedtools intersect命令参数，添加“-F 0.85 f 0.85”以限制只选择包含目标扩增子的序列，同时对真实插入/缺失片段保持灵活性。最终组装结果使用Quality Assessment Tool（QUAST）5.0.2版本进行评估（6）。

组装得到的ASFV株的核苷酸序列长度分别为172,585 bp和167,022 bp，平均覆盖率为每个核苷酸2,500至4,370个读段，GC含量分别为38.95%和39.17%（表1）。经过NCBI GenBank数据库搜索和系统发育重建（图1），本研究描述的序列与TAN/01/2011 ASFV分离株（OQ434234）（7）属于同一II型，核苷酸一致性为99.82%，查询覆盖率为100%。除了两种序列缺乏高度重复的3′和5′端粒区域外，与II型ASFV参考基因组Georgia2007/1（FR682468.2）比对后发现存在插入/缺失现象：ASFV/TAN/17/Mbozi/1在16,190–21,665位点和169,120–174,340位点分别缺失了5,465 bp和5,220 bp的片段，导致两种ASFV株的MGF 360-1Lb CDS和ASFV G ACD 01980 CDS区域发生截断。

图1

图1 使用本研究描述的ASFV全基因组核苷酸序列（用黑色圆圈标记）以及NCBI GenBank中已报道的序列构建的最大似然系统发育树。系统发育分析基于Tamura（992）核苷酸替换模型，并通过贝叶斯信息准则模型选择确定。序列比对使用MAFFT 7.221版本，系统发育树通过MEGA 12中的1,000次自助法重建。刻度条表示每个位置的核苷酸替换频率，节点值显示自助法支持百分比。

表1

表1 本研究测序结果的基本统计信息总结

分离株ID	总读段数	ASFV特异性读段数	N50值	ASFV特异性读段百分比	平均phred质量分数	组装后的ASFV基因组长度（bp）	平均基因组覆盖深度	GC含量（%）	登录号
ASFV/TAN/17/Mbozi/1	245,015	212,621	6,930	86.78	11.5	172,585	2,500	38.95	PV740684
ASFV/TAN/17/Mbozi/2	482,432	419,948	6,031	87.056	11.7	167,022	4,370	39.17	PV740683

致谢

本研究得到了Oliver R. Tambo非洲研究主席计划（ORTARChI）（DPRTC/R/126/SACIDS/1/2022）的支持，该计划得到了坦桑尼亚科学技术委员会（COSTECH）、南非国家研究基金会（NRF）、南非科学与创新部（DSI）、加拿大国际发展研究中心（IDRC）以及Oliver & Adelaide Tambo基金会（OATF）的资助。JNH是ORTARChI病毒基因组学领域的博士后研究员，同时获得了应用科学、工程和技术技能合作伙伴关系（PASET）的初级研究员研究奖（RSIF/JIRA/001）和区域奖学金与创新基金（RSIF）的资助；GM是ORTARChI病毒流行病学领域的研究员。本研究使用的流式细胞仪和PCR用DNA聚合酶由Oxford Nanopore Technologies PLC提供。