鞣化作用、抗干燥性与钙代谢的互作机制研究：以德国小蠊为模型揭示昆虫表皮成熟新策略

《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Exploring the interplay between tanning, desiccation resistance, and calcium metabolism in cockroaches

本研究针对昆虫表皮鞣化关键酶Lac-2与钙代谢的互作机制这一前沿问题，通过以德国小蠊为模型开展系统性研究，发现高钙饮食可显著改善Lac-2缺陷型个体的生存率，并首次揭示干燥应激会诱导钙化合物在体表聚集的现象。该研究为理解昆虫适应性进化及新型害虫防治策略提供了重要理论依据。

　　

在昆虫适应陆地环境的过程中，表皮结构发挥着至关重要的作用。昆虫表皮是由几丁质、表皮蛋白和碳氢化合物组成的多层结构，不仅提供物理保护，还在防止水分蒸发、抵御病原体等方面具有关键功能。然而，每当昆虫经历蜕皮后，新暴露的表皮需要快速成熟硬化才能恢复完整功能，这个阶段被称为"鞣化期"。在此期间，昆虫极易受到环境胁迫和天敌攻击。近年来，科学家提出一个新颖假说：昆虫可能通过一种名为Laccase 2（Lac-2）的酶介导的鞣化机制，减少了对钙源的依赖，从而实现了更快速的表皮成熟，这可能是昆虫成功适应陆地环境的关键因素之一。

尽管大多数昆虫物种已经放弃了矿物质强化策略而转向Lac-2驱动的鞣化过程，但一些昆虫仍然同时使用这两种过程，它们之间可能存在复杂的相互作用。目前，关于这两种策略如何协调运作的分子机制尚不明确，特别是在不完全变态昆虫中更是缺乏系统研究。为了解决这一科学问题，来自耶路撒冷希伯来大学的研究团队选择德国小蠊（Blattella germanica）作为模型生物，开展了深入探索。

德国小蠊作为一种全球性害虫和模式生物，其生物学特性已被广泛研究。本研究旨在阐明Lac-2介导的鞣化过程在德国小蠊发育过程中的动态变化，特别是探讨其与钙代谢的潜在相互作用。研究人员通过系统的实验设计，试图回答几个关键问题：鞣化过程在不同发育阶段有何变化规律？Lac-2基因的表达模式如何？当Lac-2功能受损时，钙代谢是否能够提供补偿机制？这些问题的解答不仅有助于理解昆虫基础生物学，还可能为开发新型害虫控制策略提供思路。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用RNA干扰技术特异性敲低目标基因表达；通过实时定量PCR分析基因表达模式；应用扫描电子显微镜结合能量色散X-ray光谱进行元素分析；采用生物信息学方法鉴定与甲壳类动物钙化机制相似的基因；建立干燥应激实验模型评估生理响应。

3.1. 德国小蠊胚胎后发育过程中鞣化持续时间

研究人员首先测量了德国小蠊所有发育阶段的鞣化时间，试图确定这一参数是否与表皮总面积相关。出乎意料的是，一龄若虫表现出最长的鞣化期，长达12小时。后期阶段的持续时间显著缩短，从二龄的2.7小时逐渐增加到末龄若虫到成虫蜕皮时的8小时。这种模式表明鞣化速度与表皮整体面积相关，但孵化后的表皮鞣化是个例外，暗示还有其他因素参与调控。

3.2. 选定蜕皮周期中BgerLac-2的表达模式

为了比较BgerLac-2表达模式并确定其峰值，研究人员选择了三个可能因形态转变而呈现变化的蜕皮周期。刚孵化的一龄若虫在孵化后立即表现出最高的BgerLac-2表达峰值。三龄若虫的表达峰值出现在蜕皮后期，即预测蜕皮前一天。在德国小蠊发育的最终蜕皮周期中，刚蜕皮的成年雌性显示出最高水平的BgerLac-2表达。

3.3. dsRNA诱导BgerLac-2缺陷后表型变化分析

通过RNAi方法研究BgerLac-2在德国小蠊体色和生存中的功能作用。同时评估不同钙含量饮食对BgerLac-2缺陷个体生存的影响，以探索鞣化和钙代谢之间的潜在相互作用。高钙饮食显著提高了生存率，与无钙或低钙饮食相比差异明显。饮食钙也影响了注射后第一次蜕皮存活个体的表型分布。

3.4. BgerLac-2缺陷个体角质层中的钙及其完整性

注射后约一周，高钙饮食的动物开始在其角质层上出现白色沉积物。表现出严重水分流失症状的BgerLac-2缺陷白色表型个体在其表面显示出更高密度的白色团聚物。扫描电镜-能谱分析显示，BgerLac-2缺陷动物在所有分析结构中均表现出更高的元素钙原子百分比。

3.5. 血淋巴元素组成分析

收集BgerLac-2缺陷动物在高钙饮食下的血淋巴样品，通过扫描电镜-能谱比较其元素组成。结果显示两种元素（钙和磷）的原子百分比显著增加。只有高钙饮食下的BgerLac-2缺陷动物才出现血淋巴钙水平升高，而低钙或无添加钙饮食没有引起类似效应。

3.5. 三种昆虫基因组中与甲壳类钙化基因相似基因的鉴定

研究人员选择了13个在钙化角质层区域活跃表达的甲壳类基因，在德国小蠊、橘小实蝇和黑腹果蝇的转录组库中进行BlastP搜索。BgerDD5-like基因特别值得关注，因为橘小实蝇和黑腹果蝇都没有与DD5相似度如此高的基因。

3.6. BgerDD5-like和BgerDD9A-like的表达和结构特异性分析

qPCR分析显示，在标准饮食下，BgerLac-2缺陷动物中没有上调这些目标基因。只有在高钙饮食下的干燥应激才刺激BgerDD5-like表达，而BgerDD9A-like表达似乎受其他因素调控。

3.7. 高钙饮食下德国小蠊角质层干燥后元素研究

为了确定观察到的角质层钙沉积是否与BgerLac-2缺陷直接相关或由该缺陷引起的干燥所致，研究人员对维持在高钙饮食上的未注射德国小蠊进行了干燥实验。在干燥应激下，这些动物的角质层也积累了钙，与BgerLac-2缺陷动物相似。

3.8. BgerDD5-like和BgerDD9A-like反应的特异性

研究人员旨在确定是什么触发了BgerDD5-like和BgerDD9A-like基因的表达。正常湿度下的饮食钙补充不影响这些基因的表达，单独干燥也不影响。只有干燥和高钙饮食的结合才刺激BgerDD5-like表达。

3.9. 昆虫物种中DD5-like基因的鉴定、系统发育分析及其与角质层蛋白基因的区分

由于DD5-like基因似乎在德国小蠊的钙代谢中发挥作用，研究人员对其进行了更详细的分析，检查了它在昆虫物种中的分布并进行了系统发育分析。结构域预测揭示了PjapDD5（13个结构域）和BgerDD5-like（7个结构域）中存在多个具有R&R基序的推定结构域，将它们与CPR家族角质层蛋白典型的单结构域组织区分开来。

3.10. BgerDD5-like基因的功能分析

研究人员接下来研究了BgerDD5-like在干燥抗性和团聚物形成中的功能作用。在干燥应激和高钙饮食下，BgerDD5-like缺陷动物减少了角质层钙团聚物，如光学显微镜和扫描电镜-能谱所揭示。BgerDD5-like缺陷动物的生存率在干燥条件下相比对照有所提高。

研究结论与讨论部分强调了这项工作的多方面意义。BgerLac-2的表达模式在研究的三个阶段中各不相同，表明不能推广到德国小蠊的整个胚胎后发育过程。这种阶段特异性的表达差异在其他昆虫中也有报道，这些模式通常因发育阶段覆盖范围和采样频率而异。

添加碳酸钙到饮食中改善了BgerLac-2缺陷动物的生存，但其潜在机制仍不清楚。研究人员假设这种效应可能与血淋巴中检测到的元素钙水平升高有关，表明至少一些饮食钙被高钙饮食组中的BgerLac-2缺陷动物代谢了，而其他组则没有。

BgerLac-2缺陷动物和进行干燥实验的动物中钙团聚物的出现与干燥应激的进展相吻合。检测到的角质层表面的钙可能有多种来源：它可能直接结合到角质层或相关的碳氢化合物上，可能是单独或与其他化合物一起分泌的，可能来自类似于角质层钙化的过程，或者可能来自尚未识别的机制。

研究表明，钙在角质层上的积累可能不是一种适应性反应，而实际上可能损害在干燥条件下的生存。这一发现挑战了关于昆虫对环境胁迫的生理适应的传统假设。

从进化角度来看，这项研究为理解昆虫从依赖钙化到主要依赖酶促鞣化的转变提供了重要线索。BgerDD5-like基因的发现特别值得注意，因为它与甲壳类的钙化基因相似，但在昆虫中可能已经发生了功能转变。

这项研究不仅增进了我们对昆虫生理学的理解，还为开发新型害虫控制策略提供了潜在靶点。通过针对鞣化通路或钙代谢相关基因，可能能够开发出更有效的害虫管理方法。此外，研究结果对理解昆虫如何应对气候变化引起的环境压力也具有启示意义。

总的来说，这项研究为昆虫生物学领域提供了宝贵的见解，特别是在表皮成熟、环境适应和进化权衡方面。它为进一步研究昆虫钙代谢的分子机制和Lac-2在昆虫适应性中的核心作用奠定了坚实基础。