可见光激活的氨基化聚己内酯纳米纤维支架在组织工程中的光控灭菌应用研究

《Biologicals》：Aminolyzed Polycaprolactone Nanofiber Scaffolds with Visible Light-Activated Sterilization for Tissue Engineering Applications

本研究针对组织工程支架材料面临的细菌感染风险及传统灭菌方法易损伤材料的问题，开发了一种基于氨基化聚己内酯（PCL）纳米纤维的新型光活性材料。研究人员通过共价键合玫瑰红（RB）光敏剂和一氧化氮（NO）光供体，实现了可见光（绿光/蓝光）激活的双模式抗菌效应，成功灭活大肠杆菌，并证实功能化支架不仅无细胞毒性，还能显著促进脂肪干细胞黏附增殖。该材料兼具光控灭菌和高细胞相容性的独特优势，为组织工程提供了创新解决方案。

　　

在组织工程领域，生物材料支架作为细胞生长的三维模板发挥着关键作用。然而，这类多孔结构在促进细胞黏附增殖的同时，也极易成为细菌滋生的温床，尤其是革兰氏阴性菌的定植会引发严重感染，导致植入失败。传统的灭菌方法，如热处理、伽马射线或紫外线照射、等离子体或化学灭菌等，虽然广泛应用，但往往伴随着不可忽视的副作用：它们可能引起支架材料的机械性能或形态改变，甚至因灭菌过程残留有害物质而增加材料毒性。因此，开发一种既能有效灭菌又对细胞友好、且不损害材料本身性能的消毒策略，成为了该领域面临的一大挑战。

合成生物可降解聚合物，如聚己内酯（PCL），因其良好的生物相容性和可调控的降解性能，在药物递送系统和再生医学中备受青睐。然而，PCL固有的疏水性导致其细胞附着能力较差，限制了其作为组织工程支架的应用效果。为了改善这一状况，氨基化作为一种简便的湿化学方法被引入，通过在聚酯表面引入反应性伯氨基，在不改变材料本体物理化学性质的前提下，有效增强了表面的亲水性和细胞增殖能力。其中，戊二醛作为交联剂的应用，进一步提高了材料的刚性并增强了细胞黏附性。

基于上述背景，来自捷克查理大学的研究团队在《Biologicals》上发表了一项创新性研究。他们致力于开发一种新型的光活性纳米纤维材料，该材料能够通过可见光照射实现表面灭菌，同时具备优异的细胞相容性，以满足先进组织工程应用的需求。研究团队将目光投向了光动力抗菌疗法，利用光敏剂在特定波长光照下产生活性氧物种（如单线态氧，O₂(¹Δ_g)）来杀灭微生物。此外，一氧化氮（NO）作为一种具有广谱抗菌活性且不易产生耐药性的气体信号分子，也显示出巨大的应用潜力。将这两种抗菌机制整合到一种材料中，有望产生协同或叠加的抗菌效果。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，通过静电纺丝技术制备PCL纳米纤维膜；其次，利用氨基化反应和戊二醛交联对纤维表面进行功能化修饰；进而，采用共价键合方法将玫瑰红（RB）光敏剂和/或一氧化氮光供体（NOP）固定于纤维表面；最后，通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线光电子能谱（XPS）、紫外-可见吸收光谱、稳态和时间分辨荧光光谱、单线态氧发光检测、化学检测法（如碘化物氧化法、Griess assay）以及体外抗菌实验和细胞相容性测试（使用人脂肪源性干细胞-ADSC）等一系列表征和生物学评价手段，系统评估了材料的结构、光物理性质、抗菌效能及细胞响应。

3.1. 纳米纤维膜的制备与基本表征

研究人员通过静电纺丝成功制备了 pristine PCL 纳米纤维膜（1），并依次进行氨基化（得到膜2）、与戊二醛交联（得到膜3），以及共价键合RB和/或NOP，最终获得了一系列功能化膜（2-RB, 3-NOP, 3-RB, 3-RB-NOP）。扫描电镜结果显示，所有改性膜均保持了良好的纳米纤维形貌，直径在150-400纳米之间，表面改性未引起显著的形态变化。接触角测量表明，氨基化处理提高了PCL膜的亲水性（接触角从约118°降至约91°），后续功能化虽使亲水性略有下降，但仍优于原始PCL膜。

3.2. 后修饰验证

通过Orange II染料法定量检测了膜表面的伯氨基含量，证实了氨基化的成功（膜2的氨基浓度约为1.2 × 10^–11 mol/cm²）。经戊二醛处理后（膜3），氨基含量显著降低（约2.5 × 10^–12 mol/cm²），间接证明了戊二醛的成功结合。Schiff试剂定性检测进一步确认了膜3表面醛基的存在。

3.3. X射线光电子能谱

XPS分析清晰地证实了材料表面的化学组成变化。氨基化后检测到N 1s信号；RB的成功键合通过Cl 2p和I 3d特征峰的出现得到验证；NOP的引入则通过F 1s信号（来自-CF₃基团）得以确认。

3.4. 光谱分析

UV-vis吸收和荧光光谱表明，键合到膜上的RB和NOP保持了其各自的光谱特征，没有发生明显的聚集或光谱位移，证明了功能化过程的成功且未严重改变光活性分子的性质。

3.5. 单线态氧O₂(¹Δ_g)动力学

通过直接检测1270 nm处的近红外发光，证实了含RB的膜（2-RB, 3-RB, 3-RB-NOP）在光照下能有效产生O₂(¹Δ_g)，其寿命（τ_Δ）约为11–13 μs，高于以往报道的包埋于纳米纤维内部的光敏剂所产生的O₂(¹Δ_g)寿命，这归因于RB分子共价键合在纤维表面所处的环境不同。

3.6. 外部底物的光氧化

采用碘化物氧化法评估了材料的光氧化能力。含RB的膜在绿色LED光（515 nm）照射下能有效氧化碘离子生成I₃^–，且该过程在D₂O中增强，在NaN₃（O₂(¹Δ_g)淬灭剂）存在下被抑制，证实了O₂(¹Δ_g)是主要的活性物种。同时，也检测到少量过氧化氢（H₂O₂）的生成。

3.7. 一氧化氮（NO）的光生

通过Griess assay验证了含NOP的膜（3-NOP, 3-RB-NOP）在蓝光（414 nm）照射下能够光解释放NO。3-NOP膜由于在激发波长处吸收更强，其NO光生效率高于3-RB-NOP膜。

3.8. 抗菌活性

抗菌实验针对大肠杆菌展开。结果显示，经绿光照射后，含RB的膜（2-RB, 3-RB, 3-RB-NOP）均表现出强烈的光动力灭活作用，菌落形成单位（CFU）显著减少，这主要归功于O₂(¹Δ_g)的抗菌效应。其中，2-RB膜的抗菌效果尤为突出。蓝光照射下，含NOP的膜（3-NOP, 3-RB-NOP）也显示出一定的抗菌效果，但效率低于O₂(¹Δ_g)介导的灭菌，且蓝光本身具有一定的抗菌性，增加了评估难度。联合使用绿光和蓝光照射，进一步证实了同时产生O₂(¹Δ_g)和NO的协同抗菌潜力。

3.9. 光灭菌膜的细胞相容性评估

利用人脂肪源性干细胞（ADSC）评估了材料的光灭菌后的细胞相容性。重点比较了原始PCL（1）、氨基化PCL（2）以及两个含戊二醛的光活性样品：仅产生O₂(¹Δ_g)的3-RB和同时产生O₂(¹Δ_g)与NO的3-RB-NOP。培养8天后，细胞增殖实验表明，改性膜（2, 3-RB, 3-RB-NOP）上的细胞数量均高于原始PCL膜，其中含戊二醛的光活性膜（3-RB和3-RB-NOP）促进细胞增殖的效果最为显著。免疫荧光染色显示，在光活性的、经戊二醛交联的膜上，ADSC细胞铺展良好，具有清晰的肌动蛋白（F-actin）细胞骨架，表明优异的细胞黏附和材料-细胞相互作用。而未进行光灭菌的对照组样品约有30%出现了细菌污染，凸显了光灭菌的必要性和有效性。

本研究成功开发并系统评价了一类基于氨基化PCL纳米纤维的新型光活性材料。通过巧妙的表面功能化设计，将玫瑰红（RB）光敏剂和一氧化氮光供体（NOP）共价锚定在纤维表面，赋予了材料可见光（绿光/蓝光）激活的双重抗菌能力。研究证实，绿光照射主要通过光敏剂产生高细胞毒性的单线态氧（O₂(¹Δ_g)）实现高效的表面灭菌，而蓝光照射则触发NOP释放具有广谱抗菌活性的一氧化氮（NO）。尤为重要的是，采用戊二醛作为连接剂不仅实现了光活性分子的稳固固定，还通过交联作用增强了材料的刚性，进而促进了干细胞的黏附与增殖。

该研究的重大意义在于，它巧妙地解决了组织工程支架面临的灭菌难题与生物相容性要求之间的矛盾。所制备的材料具备“按需”光控灭菌的能力，操作简便、快速（仅需15分钟光照），且避免了传统灭菌方法可能带来的材料损伤和毒性残留问题。同时，材料本身展现出优异的细胞相容性，甚至能主动支持细胞生长。这种将光控抗菌特性与高细胞亲和性融于一体的策略，为开发下一代智能型组织工程支架、抗感染伤口敷料等生物医学材料提供了新的思路和有力的技术平台，具有广阔的临床应用前景。