综述：通过优化mRNA和递送载体解锁mRNA驱动的CRISPR-Cas9基因治疗

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Unlocking mRNA-driven CRISPR-Cas9 gene therapy via optimizing mRNA and the delivery vectors

本综述系统阐述了mRNA驱动的CRISPR-Cas9基因治疗的最新进展。作者指出，尽管该技术能避免宿主基因组整合并降低脱靶效应，但其临床应用仍受限于mRNA不稳定性、免疫原性和递送效率低等挑战。文章重点分析了通过优化mRNA结构元件（5'帽、UTR、ORF、poly(A)尾）、开发新型RNA形式（环状RNA、自扩增RNA）和创新递送载体（LNP、VLP、EV等）来提升治疗效果的策略，并探讨了碱基编辑器（BEs）和引物编辑器（PEs）等新型基因编辑工具的发展前景。

　　

CRISPR-Cas9系统的三种形式对比

基因编辑领域近年来因CRISPR-Cas9系统的发展而焕发新生。这一源自细菌和古菌的适应性免疫系统，已被成功改造用于真核细胞的基因组编辑。目前，基于CRISPR-Cas9的基因治疗主要有三种形式：DNA、mRNA和核糖核蛋白（RNP）复合物。DNA形式的CRISPR-Cas9因其结构稳定、能够实现持久表达而成为最常用的形式，特别是在体外和体内基因治疗研究中。然而，这种持续表达也伴随着较高的脱靶风险，且DNA载体可能整合到宿主基因组中，带来安全隐患。

相比之下，RNP形式的CRISPR-Cas9表现出最高的编辑效率和最低的脱靶效应，但其临床应用受到制备困难、成本高昂以及缺乏高效体内递送载体的限制。例如，使用Lipofectamine 2000递送RNP形式的CRISPR-Cas9靶向TMC1突变治疗听力损失，仅能维持短暂（4周）的部分听觉功能恢复，编辑效率低于2%。

mRNA形式的CRISPR-Cas9则兼具两者优点：既避免了DNA形式的基因组整合风险，又解决了外源蛋白表达后的修饰、折叠和定位难题。mRNA能在宿主细胞中直接翻译，且可编码由多个亚基组成的复杂蛋白，确保其正确三维结构。此外，mRNA药物的生产更快速、便捷且成本较低。尽管蛋白质药物已有成熟的监管框架和审批经验，但近年来LNP技术的突破性进展使mRNA药物备受关注。

优化mRNA稳定性和翻译效率的工程策略

mRNA的不稳定性和短半衰期是限制其临床应用的主要障碍。为提高mRNA的稳定性和翻译效率，研究人员从mRNA的结构元件入手，进行了多方面的优化。

5'帽结构的理性设计

5'帽结构在RNA加工、核输出、翻译起始以及避免先天免疫系统识别中起着关键作用。最常见的帽结构是m7GpppN（Cap0），其相邻核苷酸的核糖O-2'位可进一步甲基化，形成Cap1和Cap2。体外转录（IVT）中常用的加帽方法包括酶法加帽和共转录加帽。酶法加帽过程复杂，需要多种酶和一系列反应，且需额外纯化步骤；共转录加帽则更为简便，但存在GTP和帽类似物竞争性添加到mRNA 5'末端的问题，可能导致未加帽或反向加帽mRNA的产生。研究表明，使用抗反向帽类似物（如7-methyl[3'-O-methyl]GpppG）可显著提高翻译效率。近年来开发的CleanCap^? AG帽类似物（m7Gppp(2'OMeA)pG）能在合成过程中实现94%以上的Cap1 mRNA产出。

UTR序列的优化

5' UTR的长度、二级结构、上游AUG密码子（uAUGs）和上游开放阅读框（uORFs）均可影响翻译效率。人类mRNA的5' UTR通常长度为100-210 bp，其茎环结构会阻碍40S核糖体亚基的扫描，降低翻译效率。约50%的哺乳动物mRNA 5' UTR含有uORFs和/或uAUGs，这些元件可通过调节主ORF的起始来影响翻译。目前常用的5' UTR是人α-珠蛋白的5' UTR（37个核苷酸）。研究发现，某些最小化的5' UTR（如14个核苷酸）或来自特定基因（如羧酸酯酶1D, Ces1d）的5' UTR可介导更高或组织特异性的翻译效率。

3' UTR位于终止密码子下游，参与调控mRNA的翻译、稳定性和定位。较长的3' UTR通常伴随较短的半衰期，而较短的3' UTR则翻译效率较低。AU富集元件、GU富集元件和microRNA结合位点会降低mRNA稳定性。目前常用的3' UTR序列来源于α-珠蛋白和β-珠蛋白。研究发现，串联两个β-珠蛋白3' UTR或应用新型3' UTR（如mtRNR1和AES）可显著增强mRNA的稳定性和翻译效率。

poly(A)尾的工程化

3'末端的poly(A)尾对mRNA的运输、翻译和稳定性至关重要。poly(A)尾通过真核翻译起始因子和poly(A)结合蛋白间接与5'帽结合，形成闭环结构，促进翻译。研究表明，poly(A)尾至少需要27个腺嘌呤才能有效结合PABP。短poly(A)尾（<50个核苷酸）通常会导致翻译抑制，而去除poly(A)尾则会引发脱帽和核酸外切酶介导的降解。将寡核苷酸连接到poly(A)末端或将修饰的分支poly(A)寡核苷酸连接成多尾mRNA，可增强对RNA衰变的保护，延长翻译持续时间。通常，120个单位的poly(A)序列可提供足够的稳定性和高效的翻译，但最佳长度可能因转录本而异。

ORF的优化

外源mRNA易被先天免疫受体识别并刺激免疫系统。过去十年的研究表明，化学修饰、密码子优化和去除mRNA样品中的双链RNA（dsRNA）可以减少先天免疫系统的激活，增强mRNA稳定性和翻译效率。将假尿苷（pseudouridine）、N1-甲基假尿苷（m1Ψ）或5-甲基胞苷等修饰核苷掺入治疗性mRNA序列，已成为常见策略。例如，使用5-甲氧基尿苷修饰的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）编辑Fah基因，体内编辑效率比未修饰的ABE提高约1.5倍。通过替换同义密码子生成尿苷缺失的Cas9 ORF，可降低免疫反应。密码子优化结合5-甲氧基尿苷和N1-甲基假尿苷化学修饰的Cas9 mRNA，比野生型Cas9 mRNA具有更高的编辑活性。去除Cas9双链RNA杂质可减少免疫反应并提高编辑效率。

通过结构工程增强mRNA翻译

除了优化mRNA组件，研究人员还通过结构工程策略来增强mRNA的稳定性和翻译效率。

环状RNA（circRNA）

传统的线性mRNA易被RNase通过5'-3'或3'-5' RNA衰变途径降解。可翻译的环状RNA是共价头尾连接的ssRNA分子，避免了5'和3'末端的暴露，从而具有更高的稳定性、更长的半衰期和更高的翻译丰度。置换内含子-外显子（PIE）系统广泛用于生产外源circRNA。该策略只需添加GTP和Mg²⁺作为辅因子，即可在circRNA生成过程中通过自催化核酶反应连接侧翼序列片段。circRNA通过在其开放阅读框（GOI）上游加入内部核糖体进入位点（IRES），利用帽非依赖性翻译机制招募核糖体起始翻译。与线性mRNA相比，circRNA显示出更高的稳定性和表达水平。然而，PIE环化策略不可避免地会插入最小尺寸的外源序列（如E1、E2和spacer）。为避免此问题，研究人员开发了Clean-PIE环化策略，将E1和E2序列隐藏于ORF或IRES序列内，从而消除外源序列的产生。Clean-PIE方法对约2000 bp的短RNA可实现约90%的环化率，并在体内外实现持续的蛋白质表达和降低的免疫原性。

体外转录制备circRNA需要多个步骤和无核酸酶环境。基于Tornado（Twister-optimized RNA for durable overexpression）系统的细胞内circRNA合成方法应运而生。Tornado系统涉及合成在转录本5'和3'末端含有核酶的线性RNA。核酶自催化切割后，5'和3'末端通过普遍存在的内源性RNA连接酶RtcB连接，从而在细胞内产生circRNA。实验结果表明，Tornado系统可以环化大约5000 bp的mRNA。尽管Tornado系统产生的circRNA蛋白质丰度低于线性mRNA，但其蛋白质生产水平比线性mRNA翻译系统更持久。此外，剪接体依赖的体内circRNA生产方法也被报道，该方法通过连接GOI中的上游3'剪接位点（SA）和下游5'剪接位点（SD）（称为反向剪接）来实现环化。

自扩增mRNA（saRNA）

虽然增加单次给药的mRNA量可以提高蛋白质表达，但这种方法面临固有的局限性，包括最低安全剂量阈值的限制以及mRNA数量与抗原表达之间的线性关系。saRNA通过仅需最小剂量即可实现高效表达，克服了这一限制，同时减少了副作用并实现了持久的效果。saRNA源自正链RNA病毒（如甲病毒和黄病毒）的双顺反子基因组。最常用于saRNA研究的病毒包括委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）、塞姆利基森林病毒（SFV）和辛德毕斯病毒（SINV）。saRNA与线性mRNA在结构上有很多相似之处，它是一种包含5'帽、5' UTR、编码非结构蛋白（nsPs）的基因、亚基因组启动子（SGP）、亚基因组UTR（SG-UTR）、GOI、3' UTR和poly(A)尾的ssRNA分子。nsPs由四个亚基（nsP1, nsP2, nsP3, nsP4）组成，它们编码复制酶复合物，即RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）。进入细胞质后，saRNA被翻译产生RDRP。RDRP扩增原始的saRNA链（+saRNA）产生互补的负链saRNA（-saRNA），同时也能扩增-saRNA产生+saRNA。此外，RDRP能识别SGP序列，介导下游序列的扩增以产生+sgRNA。

尽管saRNA相对于线性mRNA优势显著，但插入超过2000 bp的外源序列会导致saRNA长度超过10000 bp。过长的mRNA序列易被核酸酶降解，并对mRNA的制备和递送带来挑战。为此，研究人员开发了一种新型saRNA系统（称为反式扩增RNA系统，taRNA），它不仅克服了过长和过于复杂的限制，还能介导比典型saRNA更高效的翻译。taRNA是一个分裂载体系统，由反式复制子-GOI（TR-GOI）和非复制性mRNA（称为nrRNA-REPL）载体组成。TR-GOI通过不完全删除nsPs但保留SFV的5'保守序列元件（5' CSE）、SGP、SG-UTR和3' CSE而从saRNA工程化而来。复制酶活性则在nrRNA-REPL RNA分子上编码。nrRNA-REPL结构使用典型的RNA元件，如传统的5'帽和人α-珠蛋白的5' UTR。

用于mRNA的递送载体

安全高效的递送载体是mRNA驱动的CRISPR-Cas9基因治疗成功的关键。目前，常见的mRNA递送载体包括基于慢病毒（LV）或逆转录病毒载体理性重设计的病毒样颗粒（VLP）、细胞外囊泡（EV）、脂质纳米粒（LNP）、脂质体纳米颗粒、聚合物纳米颗粒等。

病毒样颗粒（VLP）作为递送载体

LV递送载体并非CRISPR-Cas9递送的主要平台，因为它们可能促进外源序列整合到宿主基因组中。然而，通过战略性工程改造，可以使其失去基因组整合能力，同时保留结合特定mRNA和维持感染性的能力。例如，研究人员将单体MS2衣壳（MS2C）蛋白融合到Gag-pol的N端，并在目的mRNA的终止密码子和poly(A)尾之间插入一个六重复茎环结构。MS2C蛋白能特异性识别这种茎环结构（称为MS2茎环），从而实现特定的mRNA包装。该新型递送系统被命名为mLPs。基于mLP平台，将CRISPR-Cas9 mRNA（mLP-CRISPR）递送至小鼠模型中以靶向血管内皮生长因子A（Vegfa），用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。单次视网膜下注射mLP-CRISPR在视网膜色素上皮中敲除了44%的Vegfa，且未诱导脱靶编辑或抗Cas9免疫反应。类似地，选择性内源性 encapsidation 用于细胞递送（SEND）系统利用PEG10蛋白（一种Gag蛋白同源物）能特异性识别并结合自身非翻译区域的特性，将目的mRNA侧翼连接PEG10的UTR，从而实现了CRISPR-Cas9 mRNA的稳健编辑活性。

细胞外囊泡（EV）作为递送载体

EV是近年来出现的可行mRNA递送平台。EV由细胞内源性产生，因此具有较低的炎症反应，并继承了亲本细胞的特性。因此，EV是工程化靶向特异性递送载体的理想候选者，允许重复给药用于治疗应用。尽管EV在生物相容性和低免疫原性方面具有显著优势，但其主要缺点是需要解决EV内大量异质性mRNA的包装问题。

脂质纳米粒（LNP）作为递送载体

LNP是最有前景的RNA递送平台之一，并已获得FDA批准用于mRNA药物递送。LNP是具有磷脂单层结构的生物相容性载体，可通过静电作用将mRNA包裹在其内部，从而保护mRNA免受RNase降解。LNP制剂通常包含可电离阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG化磷脂。其中，可电离阳离子脂质是最关键的组分，它决定了mRNA在LNP中的封装效率以及促进纳米颗粒从内体逃逸的能力，这两者都影响mRNA的递送和转染效率。辅助脂质增强了LNP的整体相变温度和稳定性，并有助于内体逃逸。胆固醇有助于LNP脂质层的稳定性，并增强mRNA的细胞内摄取和胞质进入。位于LNP表面的PEG化磷脂提高了LNP的亲水性，减少LNP聚集，防止免疫系统清除，并增加LNP的稳定性。

在早期研究中，阳离子脂质常被用于LNP制剂来递送mRNA。然而，含有阳离子脂质的LNP在体内可能引起肝毒性增加和免疫反应，这归因于其强正电荷和无法从内体有效逃逸。为了规避这些挑战，可电离阳离子脂质被广泛研究用于mRNA递送。这些可电离阳离子脂质能够根据pH变化改变其电荷，从而通过"翻转"或"质子海绵"等机制最大限度地减少毒性并增强内体逃逸。FDA批准的采用可电离脂质（如DLin-MC3-DMA）的LNP递送系统被设计用于使用RNAi治疗转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性。此后，LNP技术作为基因编辑工具和mRNA疫苗的递送平台引发了极大兴趣。例如，Finn等人开发了含有可电离LP01脂质的LNP载体，用于递送靶向TTR基因的CRISPR-Cas9 mRNA，以治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性小鼠模型。单次给药诱导了97%的TTR蛋白降低，且效果持续至少1年。Moderna和BioNTech/Pfizer的COVID-19疫苗mRNA-1273和BNT162b2也分别在其LNP制剂中使用了可电离阳离子脂质（如ALC-0315和ALC-0135）。

脂质体作为递送载体

脂质体作为基于纳米颗粒的核苷酸递送载体也被广泛研究。与LNP的单层结构不同，脂质体具有磷脂双分子层结构。脂质体的双层脂质膜结构类似于细胞膜，使其易于与细胞融合，从而实现高转染效率。此外，脂质体可以利用光、pH、超声波、磁场等各种刺激来时空控制CRISPR-Cas9药物的释放，从而提高编辑效率并减少脱靶效应。例如，研究人员开发了光触发脂质体，通过将光敏分子掺入脂质双层中用于递送CRISPR-Cas9 RNP。在690 nm光照射下，脂质体结构不稳定，导致CRISPR-Cas9释放。

聚合物纳米颗粒作为递送载体

聚合物纳米颗粒是另一类mRNA递送载体。含有柔性长聚合物链的聚合物纳米颗粒可以参与静电吸引、疏水相互作用和额外的物理纠缠，因此比许多其他纳米颗粒更稳定。例如，聚乙烯亚胺（PEI）聚合物家族包含多种线性和支链成员。支链PEI具有强离子电荷，便于通过压缩带负电荷的核酸形成复合物来实现高效包装，屏蔽核酸免受核酸酶降解，并且这些载体的pH缓冲能力有助于核酸的细胞内内体逃逸。

基于肽的递送载体

近年来，基于肽的RNA药物递送平台显示出巨大潜力。治疗性肽通常长度为7-50个氨基酸，并呈现阳离子电荷状态。基于肽的RNA药物递送平台分为独立载体和与其他载体结合的载体。在独立载体平台中，带正电的阳离子肽通过静电相互作用将带负电的mRNA浓缩成纳米颗粒大小。例如，简单混合ADGN肽和CRISPR-Cas9 RNA即可形成稳定的纳米颗粒，全身静脉注射后可在体内肺细胞中实现有效的靶向基因编辑。具有组织特异性靶向能力的肽通常用于修饰递送载体的表面，以进一步增强递送性能或组织特异性。例如，LNP递送mRNA仅限于视网膜色素上皮和米勒胶质细胞，无法转染视觉光转导细胞。通过噬菌体展示技术筛选肽，并用候选肽配体修饰的LNP递送mRNA，在视觉光转导细胞中显示出强大的蛋白质表达。

靶向特异性mRNA递送

高效且靶向特定细胞和组织的递送决定了mRNA药物的治疗效果并最大限度地减少了脱靶副作用。最流行的基于LNP的mRNA递送载体倾向于在肝脏中积聚，因此需要绕过肝脏以靶向各种器官，从而最大化基于LNP的mRNA治疗潜力。在基于LNP的mRNA递送平台中，已经进行了许多绕过肝脏的努力。例如，在传统的四种LNP分子中添加第五种带电分子，实现了mRNA向肺和脾脏的特异性递送。利用与LNP外部PEG结合的双特异性抗体，实现了细胞特异性mRNA递送LNP。通过修饰LNP表面的表皮生长因子受体和叶酸水解酶1（PSMA）的双特异性抗体，能够在体内肿瘤组织中实现mRNA表达，与未靶向修饰相比增加约8倍。

水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）是用于VLP RNA递送系统最常用的包膜蛋白。VSV-G与低密度脂蛋白受体（LDL-R）家族成员相互作用，而LDL-R家族广泛分布于不同细胞类型中。工程化的VSV-G已成功实现细胞特异性递送。例如，将CD19 scFv（单链可变片段）融合到VSV-G N端，产生包装Cas9 RNP复合物的VLP。此外，还创建了共表达B细胞配体CD19+和EGFP的HEK293T细胞系（CD19&EGFP HEK293T），以评估CD19-scFv-Cas9-EDV在CD19+和CD19-细胞中的编辑效率。在HEK293T和CD19&EGFP HEK293T细胞约3:1的混合液中，CD19-scFv-Cas9-EDV仅诱导CD19+ EGFP+细胞发生编辑。另一种方法是将抗体结合蛋白（proteinAG）融合到VSV-G N端区域，开发了一个名为DIRECTED（通过包膜设计递送至预期受体细胞）的模块化平台。DIRECTED平台通过使用scFv抗体分离融合和靶向功能，它提供了一种更便捷、易于适应的方法来靶向不同的细胞或组织，只需在回收VLP之前更换靶向抗体（scFv）即可。

基于CRISPR-Cas9 mRNA的临床试验

CRD-TM-001（NCT05514249）项目涉及使用rAAV9载体体内递送靶向杜氏肌营养不良症（DMD）基因的CRISPR-Cas9，用于治疗DMD。不幸的是，据报道首位患者在给药后6天出现急性失代偿性持续心脏骤停，并于2天后死亡。死亡原因未明确说明，但高剂量rAAV9治疗可能导致毛细血管渗漏到患者肺部，造成肺损伤和强烈免疫反应。载体生物分布数据分析显示肝脏中Cas9表达极低，表明死亡原因与CRISPR-Cas9无直接关系。这凸显了递送载体是介导CRISPR-Cas9临床治疗的关键因素。

NTLA-2001项目（NCT04601051）是首个利用CRISPR-Cas9 mRNA的临床试验。该试验使用LNP封装靶向TTR基因的sgRNA和Cas9 mRNA，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性。1期临床试验证明单次给药后可持久敲除TTR，后续系列安全性评估仅显示少数轻微不良事件。5/6的患者在体内给药后1天显示D-二聚体水平升高，但所有患者在第7天时该值均恢复基线。肝功能代表性指标（如天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶水平）保持正常。在第14天观察到剂量依赖性药效学效应，表明血清TTR蛋白浓度较基线降低。此外，在临床前研究中药物效应达到永久最低点的第28天，接受0.1和0.3 mg/kg剂量组的患者血清TTR蛋白浓度平均较基线分别降低了52%和87%。几种脱靶预测方法（如Cas-OFFinder、GUIDE-seq和SITE-seq）确定了七个潜在的脱靶位点。使用下一代测序，在sgRNA的3倍剂量反应范围（0.007至15.5 nM）内使用NTLA-2001，未发现这些位点存在脱靶编辑（编辑比率≤0.5%）的证据。高剂量NTLA-2001（即0.7和1.0 mg/kg）也在NYHA I/II级心力衰竭受试者中进行了评估，其中一剂（0.7 mg/kg）用于NYHA III级心力衰竭受试者。所有受试者的血清TTR水平均较基线显著降低（第28天平均值>90%），并且降低的水平维持了4-6个月。12名患者中有2名报告了短暂输注反应，但均未留下任何临床后遗症。

VERVE-101项目（NCT05398029）是首个利用基于LNP递送编码ABE编辑器的mRNA的临床研究，它使用单一的sgRNA靶向PCSK9以去除LDL胆固醇，用于治疗杂合子家族性高胆固醇血症。VERVE-101试验作为heart-1临床试验的一部分，已公布了10名接受VERVE-101输注的患者的结果。6/10患者接受了亚治疗剂量（0.1 mg/kg, n=3 和 0.3 mg/kg, n=3），而4/10患者接受了潜在治疗剂量（0.45 mg/kg, n=3, 0.6 mg/kg, n=1）。两名患者在接受0.45 mg/kg剂量后，LDL-C分别降低了39%和48%，PCSK9水平分别降低了59%和84%。接受0.6 mg/kg剂量后，LDL-C降低55%持续长达180天，PCSK9水平降低了47%。两名患有晚期冠状动脉疾病的患者发生了严重不良心血管事件，包括心脏骤停、心肌梗死和心律失常。评估表明，两名患者中仅有一人的不良事件可能与治疗有关。

目前，基于CRISPR-Cas9的临床研究更侧重于体外编辑，例如体外修饰T细胞或CD34阳性造血干细胞和造血祖细胞，然后将其回输给患者以治疗疾病。

CRISPR-Cas9基因治疗的发展趋势

CRISPR-Cas9系统使用sgRNA将Cas9蛋白引导至靶DNA序列，随后Cas9诱导DNA双链断裂（DSBs）。这些DSBs主要通过两种途径修复：非同源末端连接或同源定向修复。然而，CRISPR-Cas9可能在非预期位点诱导DSBs，这可能导致染色体重排、必需人类基因功能紊乱以及随之而来的重要细胞功能丧失。

基于Cas9切口酶（Cas9n, D10A或H840A）开发的新型基因编辑器提供了一种规避严重DSBs诱导的方法。这些基于Cas9n的编辑器能够在可编程靶位点直接将一种DNA碱基转换为另一种，仅产生单链断裂。基于Cas9n，已经开发了各种新型编辑器，包括碱基编辑器（BEs）和搜索替换基因组编辑技术（即引物编辑器PEs）。例如，胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）催化C?G碱基对转换为T?A，而腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）催化A?T转换为G?C。此外，C-to-G BEs诱导C-to-G碱基颠换，腺嘌呤颠换碱基编辑诱导C-to-G和A-to-Y（Y=C,T）颠换。这些BE方法依赖于C和A的脱氨作为关键步骤，分别产生脱氧尿苷（U）和脱氧肌苷（I）中间体。最近，研究人员开发了一种无脱氨酶的基于糖基化酶的鸟嘌呤（G）BE，通过将Cas9n与工程化的N-甲基嘌呤DNA糖基化酶蛋白融合，催化G到Y（Y=C, T）的转换。

新型BEs能够介导高水平的编辑活性，但其宽泛的编辑窗口（通常为4-8个核苷酸）增加了旁观者效应的风险，从而可能诱导错义或终止密码子突变。研究人员利用蛋白质工程技术基于ABE8e开发了一种新型ABE，即ABE9。ABE9将编辑窗口精炼至1-2个核苷酸，同时保持高编辑活性。这一变化标志着在增强碱基编辑技术的精确性和特异性方面迈出了重要一步，使得ABE9更适合精确的基因组编辑应用。因此，除了扩大其靶向范围和增强编辑活性外，应高度重视编辑特异性的提升，例如精炼编辑窗口。

尽管所有BEs的组合可以介导12种可能的碱基间转换，但单个BE难以修复所有