过氧化氢诱导氧化应激对肠出血性大肠杆菌O157:H7转录组和蛋白质组的全面调控及其毒力影响

《Heliyon》：Transcriptomic and proteomic analysis of the effect of hydrogen peroxide on enterohemorrhagic Escherichiacoli

本研究针对肠出血性大肠杆菌(EHEC)在氧化应激环境下毒力调控机制不明确的问题，通过转录组和蛋白质组学分析，系统揭示了H2O2胁迫对EHEC O157:H7 EDL933菌株的全局调控网络。研究发现H2O2暴露激活了复杂的酶促和非酶促防御机制，同时显著影响Stx1/Stx2毒素、黏附因子等染色体/噬菌体/质粒编码毒力相关性状的表达。该研究为阐明EHEC在宿主内的适应机制和开发新型防控策略提供了重要理论基础。

　　

在我们日常生活的环境中，存在着一种令人闻之色变的食源性致病菌——肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)。这种病原菌主要通过污染的食物和水源传播，感染后可引起血性腹泻、腹部绞痛等胃肠道症状，约10%-20%的患者会发展为严重的溶血性尿毒综合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)，尤其对儿童威胁巨大，病死率可达1%-4%。EHEC的主要毒力因子是志贺毒素(Shiga toxin, Stx)，由Stx噬菌体编码，在DNA损伤等因素诱导下可大量产生。

值得注意的是，抗生素治疗EHEC感染可能适得其反——虽然能杀死细菌，但同时会诱导Stx毒素大量释放，增加HUS风险。这背后的机制与细菌的SOS反应密切相关：当细菌DNA受损时，会启动一套应急修复机制，同时激活溶源性噬菌体进入裂解周期，导致毒素释放。在人体肠道内，EHEC会遭遇肠上皮细胞产生的活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)，如过氧化氢(H₂O₂)，这些氧化应激同样可能触发SOS反应。然而，H₂O₂对EHEC的全局调控网络，特别是对毒力表达的影响机制尚不明确。

为了解决这一科学问题，挪威生命科学大学兽医医学院食品安全单位的Marina Aspholm教授团队在《Heliyon》上发表了最新研究成果。研究人员采用转录组测序(RNA-Seq)和蛋白质组学分析，系统阐述了H₂O₂诱导的氧化应激对EHEC O157:H7参考菌株EDL933的全局影响，特别关注了与氧化应激防御和毒力表达相关的调控网络。

研究采用的主要技术方法包括：细菌培养与H₂O₂处理（3mM浓度）、生长曲线测定（光密度和菌落形成单位计数）、RNA提取与转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）、蛋白质提取与质谱分析（液相色谱-质谱联用技术）、生物信息学分析（差异表达基因和蛋白质鉴定）等。

3.1. 全局变化

H₂O₂暴露导致EDL933生长立即停滞约5小时，菌落形成单位(CFU)数量在2小时内下降近1个数量级，表明细菌经历了明显的氧化应激损伤。转录组分析显示，在5370个注释基因中，2229个(41.5%)基因表达发生显著改变，其中1301个上调，928个下调。蛋白质组分析在3小时和12小时时间点分别检测到22个和184个差异表达蛋白质。

3.2. 氧化应激反应相关DE基因

H₂O₂暴露导致23个氧化损伤防御和修复相关基因差异表达。同源重组、DNA复制、碱基和核苷酸切除修复等相关基因显著上调，而组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸合成通路则普遍下调。三羧酸循环(TCA cycle)受到抑制，而磷酸戊糖途径上调，可能有利于还原型谷胱甘肽的生成。

3.3. 核糖体

核糖体基因和蛋白质表达普遍上调，表明细菌通过增强蛋白质合成应对应激。然而，与休眠相关的核糖体调节因子(Rmf)和休眠促进因子(Hpf)表达下降，反映细菌并未进入真正的稳定期。

3.4. SOS反应

H₂O₂暴露激活了SOS反应，关键基因recA(编码重组蛋白RecA)表达上调13倍，相应蛋白质水平也显著增加。大多数DNA修复相关基因均上调，但细胞分裂抑制蛋白SulA在3小时时间点蛋白质水平下降50倍，可能与细菌形态维持有关。

3.5. LEE致病岛和其他黏附相关基因

H₂O₂暴露导致肠细胞脱落位点(LEE)致病岛的35个基因下调2.1-114.2倍，其中8个III型分泌系统(T3SS)蛋白在3小时时间点表达下降。这可能减弱细菌对肠上皮的黏附，有利于细菌从高ROS环境逃离。然而，一些非LEE黏附因子(如fepA和ehaG)表达上调，可能在应激条件下介导替代性黏附机制。

3.6. 运动性

44个鞭毛运动和趋化相关基因表达上调3.1-12.7倍，表明细菌通过增强运动性逃离氧化应激环境。趋化受体Aer和Tsr显著上调，可能介导对氧和氧化物的趋化反应。

3.7. pO157致病性质粒

pO157质粒上的31个基因表达发生改变。肠溶血素基因簇(ehxABCD)上调5.1-6.9倍，而黏蛋白酶基因stcE下调12.2倍，可能减少中性粒细胞浸润。过氧化氢酶基因katP上调8.2倍，增强对氧化应激的抵抗。

3.8. 噬菌体相关蛋白和基因

128个噬菌体来源基因差异表达，其中39个来自Stx2噬菌体BP-933W，23个来自Stx1噬菌体CP-933V。Stx2A和Stx2B毒素亚基基因分别上调6.8和5.7倍，12小时时间点噬菌体相关蛋白质总量增加一倍，表明H₂O₂诱导了噬菌体元件的积累。

3.9. 铁获取

19个铁获取相关基因显著上调，其中sufABCDSE操纵子(编码铁硫载体)上调111-500倍。铁载体肠菌素(enterobactin)合成和运输相关基因也普遍上调，但在蛋白质水平表现更为复杂。

3.10. 翻译后修饰

转录组和蛋白质组数据在功能水平一致，但单个基因/蛋白质相关性较弱，可能与翻译后修饰、蛋白质提取效率差异以及采样时间点不同有关。

本研究通过多组学分析揭示了EHEC应对H₂O₂诱导氧化应激的复杂调控网络，发现氧化应激不仅激活了细菌的防御机制，还显著影响了许多关键毒力因子的表达。这些发现为理解EHEC在宿主内的适应机制提供了新视角，对开发针对EHEC感染的新型防控策略具有重要指导意义。值得注意的是，大量差异表达基因的功能尚未知，表明EHEC的氧化应激应答机制仍有广阔的研究空间。