细菌外毒素触发的植物免疫反应通过BAK1/BKK1通路抑制病原菌生长

《Cell Reports》：A bacterial exotoxin-triggered plant immune response restricts pathogen growth

本研究针对植物如何区分根系微生物群中的有益菌和病原菌这一关键科学问题，通过比较两种亲缘关系密切但生活方式不同的荧光假单胞菌，揭示了细菌外毒素（特别是丁香霉素SYR）在触发植物免疫反应中的核心作用。研究发现，植物通过BAK1/BKK1/CERK1依赖的免疫机制感知外毒素，从而区分病原菌和有益菌，这一发现为理解植物-微生物互作提供了新视角。

　　

在自然界中，植物根系与复杂的微生物群落形成密切的共生关系，这些微生物中既有促进植物生长的有益菌，也有导致疾病的病原菌。然而，一个长期困扰科学家的问题是：植物如何能够精准地区分这些亲缘关系密切但生活方式迥异的微生物伙伴？特别是在缺乏适应性免疫系统的情况下，植物仅依靠先天免疫系统来完成这一"敌我识别"任务，这其中的机制令人着迷。

传统观点认为，植物主要通过识别微生物相关分子模式（MAMPs）来启动免疫反应，但问题是，MAMPs在病原菌和有益菌中高度保守，难以提供足够的分辨率。另一方面，效应子触发免疫（ETI）虽然能够识别特异性病原菌，但需要植物进化出相应的细胞内受体，且对不依赖效应子的病原菌无效。这种识别机制的局限性使得植物在面对快速进化的微生物群落时显得力不从心。

为了解开这一谜题，David Thoms等研究人员在《Cell Reports》上发表的最新研究，选择了一个理想的实验系统：两种亲缘关系密切的假单胞菌菌株——有益菌Pseudomonas brassicacearum WCS365（WCS365）和病原菌Pseudomonas sp. N2C3（N2C3）。这两种菌株的16S rRNA序列相似度高达99.4%，在微生物组研究中通常被视为同一个操作分类单元，但它们对植物的影响却截然不同。其中，病原菌N2C3通过产生脂肽外毒素syringomycin（SYR）和syringopeptin（SYP）来发挥致病作用，这些孔洞形成毒素能够在宿主膜上形成离子通道。

研究人员首先发现了一个有趣的现象：在体外培养条件下，有益菌WCS365并不能竞争过病原菌N2C3；然而在植物根际，WCS365却能够显著胜过N2C3。这种竞争差异的植物依赖性提示，植物免疫系统可能在调控微生物竞争中发挥着关键作用。

通过使用氧化应激报告基因pPER5::mVenusx3，研究人员观察到，病原菌N2C3能够在根成熟区强烈诱导免疫相关基因的表达，而有益菌WCS365则几乎不引起免疫反应。令人惊讶的是，两种菌株的MAMPs具有相似的免疫原性，且它们在根部的定殖模式也基本一致，这说明免疫反应的差异并非源于传统的MAMP识别。

进一步的RNA测序分析揭示了更为深入的机制：病原菌N2C3能够诱导超过10,000个差异表达基因，而缺失外毒素合成基因的N2C3突变株（ΔSYRΔSYP）仅诱导2,270个基因，有益菌WCS365更是只诱导了94个基因。特别值得注意的是，N2C3诱导的基因中有82%与损伤相关分子模式AtPep1诱导的基因重叠，这表明外毒素可能通过模拟损伤信号来触发免疫反应。

为了验证外毒素的直接作用，研究人员纯化了SYR毒素并进行了一系列实验。结果发现，纯化的SYR能够诱导产生延迟的活性氧（ROS）迸发，并且这一过程依赖于BAK1/BKK1/CERK1（bbc）这些模式触发免疫（PTI）共受体。更重要的是，预先用SYR处理植物能够显著抑制病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）的生长，且这种保护作用部分依赖于bbc基因。

关键实验表明，在bak1/bkk1突变体植物中，有益菌WCS365对病原菌N2C3的竞争优势显著减弱，而在cerk1突变体中影响较小，在bik1突变体中反而增强。这些结果说明，外毒素触发的免疫反应依赖于BAK1/BKK1信号通路，而不依赖于传统的BIK1信号传导。

主要技术方法

本研究采用 hydroponic（水培）系统进行细菌竞争实验，通过荧光标记技术（mTurquoise2、mNeonGreen、E2-Crimson）定量监测细菌生长。利用pPER5::mVenusx3报告基因系统可视化免疫反应空间分布。通过RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化，qPCR验证基因表达。使用luminol化学发光法检测活性氧（ROS）迸发，并通过细菌叶浸润实验评估免疫诱导的抗病性。实验材料包括拟南芥野生型（Col-0）和各种免疫信号通路突变体。

植物依赖的竞争优势

研究发现，有益菌WCS365在根际环境中能够显著胜过病原菌N2C3，但在体外培养条件下两者生长无显著差异。如图1所示，在5天的根际竞争实验中，WCS365在与N2C3共培养时比与自身共培养时提前进入稳定期，最终菌量显著更高。这种植物依赖的竞争现象表明，微生物之间的相互作用受到植物因素的调控。

差异化的免疫识别

通过比较两种菌株对植物免疫系统的影响，研究人员发现病原菌N2C3能够在根成熟区强烈诱导防御相关基因（PER5、MYB51、ELF4）的表达，而有益菌WCS365几乎不引起免疫反应。值得注意的是，两种菌株的MAMPs具有相似的免疫原性，且定殖模式基本一致，说明免疫反应的差异并非源于传统的模式触发免疫（PTI）识别。

外毒素依赖的转录组响应

RNA测序分析显示，病原菌N2C3诱导的转录组响应显著强于其外毒素缺失突变株（ΔSYRΔSYP）和有益菌WCS365。主成分分析表明，第一个主成分（PC1）能够清晰地区分不同处理组，并且这一区分主要依赖于SYR和SYP外毒素。基因富集分析显示，这些外毒素相关基因显著富集于免疫反应、氧化应激等生物学过程。

核心信号通路的独立性

出乎意料的是，研究人员发现N2C3外毒素依赖的免疫反应不依赖于已知的主要防御激素通路（茉莉酸、水杨酸、脱落酸、乙烯、油菜素内酯）或关键免疫组分（RBOHD）。即使使用钙离子通道阻断剂verapamil处理，也没有显著影响外毒素诱导的基因表达。

外毒素的直接免疫诱导作用

纯化的SYR毒素能够诱导延迟的ROS迸发，这一过程依赖于BAK1/BKK1/CERK1（bbc）信号通路。同时，SYR处理能够显著诱导防御相关基因（ACS6、WRKY33、NHL10）的表达，但基因诱导不依赖于bbc基因。此外，预先用SYR处理植物能够显著抑制病原菌生长，且这种保护作用部分依赖于bbc信号通路。

免疫受体依赖的竞争调控

在bbc三重突变体和bak1/bkk1双突变体植物中，有益菌WCS365对病原菌N2C3的竞争优势显著减弱，而在cerk1单突变体中影响较小。这些结果表明，根际微生物竞争主要依赖于BAK1和BKK1信号通路，而不是传统的MAMP识别通路。

研究结论与意义

本研究系统阐明了植物通过感知细菌外毒素来区分亲缘关系密切的有益菌和病原菌的新机制。研究发现，孔洞形成毒素（如SYR）能够触发BAK1/BKK1/CERK1依赖的免疫反应，从而在根际微生物竞争中发挥关键作用。这一发现不仅揭示了植物免疫系统的新功能，还为理解宿主-微生物互作的进化提供了重要见解。

特别值得注意的是，外毒素触发的免疫反应在信号传导机制上表现出独特特征：虽然生理响应（如ROS迸发）依赖于PTI共受体，但转录组响应却独立于已知的主要防御通路。这种信号传导的"解耦"现象提示可能存在新的免疫识别机制。

该研究的创新性在于将细菌外毒素感知与根际微生物群落调控联系起来，提出了"毒素触发免疫"的新概念。由于孔洞形成毒素在微生物中广泛存在，且容易通过水平基因转移在不同菌株间传播，这种识别机制可能为植物提供了一种快速响应微生物生活方式变化的监测手段。

这些发现对农业可持续发展具有重要意义，为开发新型微生物制剂和植物保护策略提供了理论依据。通过调控植物对外毒素的免疫感知，可能能够优化根际微生物群落结构，增强植物对病原菌的抵抗力，同时促进有益菌的功能发挥。

未来研究需要进一步阐明外毒素感知的具体分子机制，探索不同类型孔洞形成毒素的免疫识别特性，并在更广泛的植物-微生物系统中验证这一机制的普适性。此外，了解有益菌如何规避这种毒素触发的免疫反应，也将为微生物-植物共生关系的调控提供新思路。