染色质重塑因子EP400通过抑制CENP-A异位沉积维护染色体稳定性的机制研究

《Cell Reports》：Chromatin remodeling activity of EP400 safeguards chromosomal stability by preventing CENP-A mislocalization

本研究针对CENP-A过表达导致的染色体不稳定性(CIN)问题，揭示了NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物核心组分EP400通过其ATP酶依赖的染色质重塑活性，在抑制CENP-A向非着丝粒区域错定位中的关键作用。研究人员发现EP400功能缺陷细胞中CENP-A的错定位依赖于分子伴侣DAXX，且表达ATP酶活性缺失突变体EP400K1085G的细胞表现出显著的CIN表型。该研究为理解肿瘤中染色体不稳定的发生机制提供了新视角。

　　

在细胞分裂的精密舞蹈中，着丝粒扮演着指挥家的角色，确保遗传物质能够准确无误地传递给子代细胞。这一过程的核心是一种特殊的组蛋白变异体——着丝粒蛋白A(CENP-A)，它如同着丝粒区域的"分子身份证"，通过表观遗传学机制定义着丝粒的位置。然而，当CENP-A的表达失控，这种重要的身份标识就会错误地出现在基因组的其他区域，引发染色体分离错误、微核形成等染色体不稳定性(CIN)表型，而这些正是癌症细胞的典型特征。

近年来研究发现，CENP-A的过表达现象在乳腺癌、胃癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤中普遍存在，且与疾病进展和不良预后密切相关。更令人担忧的是，过表达的CENP-A会"迷路"到非着丝粒区域，这些异位沉积的CENP-A不仅可能干扰正常基因表达，还会"诱骗"其他着丝粒蛋白如CENP-C等一同错位，从而削弱正常着丝粒的功能完整性。尽管科学家们已经意识到这一问题的严重性，但对于细胞如何防止CENP-A错位的分子机制仍知之甚少。

为了解决这一科学难题，美国国立卫生研究院国家癌症研究所的Munira A. Basrai团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现。研究人员通过两项高通量RNAi筛选，意外地发现NuA4组蛋白乙酰转移酶复合物的多个成员在调控CENP-A定位中扮演关键角色。其中，EP400作为该复合物的核心ATP酶组分，成为筛选结果中最突出的候选因子。

研究人员采用的主要技术方法包括：基于hTERT-RPE1近二倍体细胞系建立的可诱导GFP-CENP-A过表达系统；定量染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析CENP-A的基因组分布；ATP酶缺陷型EP400^K1085G突变体的功能表征；活细胞成像技术分析染色体分离动力学；以及生化方法评估CENP-A的染色质结合稳定性。

Mislocalization of CENP-A to non-centromeric regions in EP400-depleted RPE1 cells

研究人员首先在HeLa细胞中验证了RNAi筛选结果，发现EP400缺失确实导致核内CENP-A信号强度增加1.7倍。随后在RPE1Tet-GFP-CENP-A模型中，通过中期染色体铺片技术观察到EP400缺失细胞中着丝粒区域和非着丝粒区域的CENP-A信号强度分别增加1.5倍和4.6倍。更重要的是，内源性CENP-A也同样出现错定位现象，表明这一效应不依赖于CENP-A的过表达。亚细胞分级实验进一步显示，EP400缺失导致GFP-CENP-A在染色质组分中显著富集，且这一现象在整个细胞周期中持续存在。

The HAT activity of KAT5 prevents CENP-A mislocalization in RPE1 cells

研究发现NuA4复合物的另一个关键组分KAT5同样参与调控CENP-A定位。KAT5缺失或使用其特异性抑制剂TH1834处理细胞，均导致CENP-A在非着丝粒区域的信号强度增加4倍以上。当同时缺失EP400和KAT5时，CENP-A错定位程度与单基因缺失相当，且染色质组分中H4K12ac水平同样降低，表明这两个因子可能通过同一通路发挥作用。

RPE1 cells depleted for EP400 show higher genome-wide mislocalization of CENP-A

通过基于单倍型解析的RPE1参考基因组的CENP-A ChIP-seq分析，研究人员获得了CENP-A在全基因组范围内分布的高分辨率图谱。结果显示，EP400缺失细胞中CENP-A在着丝粒和非着丝粒区域均出现显著富集。特别值得注意的是，在着丝粒的主要α卫星阵列区域，尤其是着丝粒核心区域(CDRs)，CENP-A的富集程度在EP400缺失条件下明显增加。

DAXX contributes to the mislocalization of CENP-A and CENP-C in EP400-depleted RPE1 cells

机制探索发现，组蛋白H3.3分子伴侣DAXX在EP400缺失导致的CENP-A错定位中起关键作用。当同时缺失EP400和DAXX时，CENP-A和CENP-C的错定位现象被完全抑制，恢复到正常水平，表明DAXX是EP400下游的重要效应因子。

ATP-dependent chromatin remodeling activity of EP400 prevents mislocalization of CENP-A and CENP-C in RPE1 cells

为了明确EP400的具体作用机制，研究人员构建了ATP酶活性缺陷的EP400^K1085G突变体。令人惊讶的是，表达该突变体的细胞表现出更为严重的CENP-A错定位（非着丝粒区域信号强度增加9.3倍）和CENP-C错位（增加3.7倍）。生化分析显示，EP400^K1085G细胞中CENP-A的半衰期显著延长（30.2小时对17.6小时），且在高盐条件下从染色质中提取CENP-A的效率降低，表明EP400的染色质重塑活性对于CENP-A与染色质的动态结合至关重要。

RPE1Tet-GFP-CENP-A cells expressing an EP400 mutant defective for ATP-dependent chromatin remodeling function exhibit CIN phenotypes

功能实验证实，EP400^K1085G细胞表现出明显的染色体不稳定性表型：有丝分裂退出时间延长（27.7分钟对22.5分钟），染色体分离错误（滞后染色体和DNA桥）比例增加（12%对4%），以及微核形成率升高（4.6%对2.7%）。这些结果直接将EP400的染色质重塑功能与染色体稳定性维护联系起来。

本研究的重要发现在于阐明了EP400通过其ATP酶依赖的染色质重塑活性，防止CENP-A在非着丝粒区域稳定结合的新机制。在正常情况下，EP400可能通过瞬时解聚核小体结构，使错误沉积的CENP-A易于被细胞质量控制机制识别和清除。而当EP400功能受损时，CENP-A与染色质的结合变得异常稳定，导致其在这些位点积累，进而通过DAXX依赖的机制促进CENP-C等着丝粒蛋白的错位，最终削弱功能性着丝粒的组装，引发染色体分离错误。

值得注意的是，EP400、KAT5和TRRAP等NuA4复合物组分在多种癌症中存在突变，尤其是在皮肤癌和肺癌中，EP400 ATP酶结构域的突变与较高的非整倍性评分相关。这一发现为理解肿瘤发生中染色体不稳定的分子基础提供了新视角，同时也提示靶向EP400-CENP-A通路可能成为治疗特定类型癌症的新策略。

该研究的创新性在于将染色质重塑因子的核小体解聚功能与着丝粒表观遗传学的维持机制联系起来，揭示了细胞防止CENP-A错位的一种质量监控机制。未来研究可进一步探索EP400如何特异性识别非着丝粒区域的CENP-A，以及这种识别是否受到特定染色质特征的调控。此外，在临床层面，评估EP400突变与CENP-A错定位的关联性，可能为癌症的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶点。