仔猪粪便肠道炎症生物标志物的分析验证、均质性与稳定性研究

《Veterinary and Animal Science》：Fecal intestinal inflammatory biomarkers in piglets: analytical validation, homogeneity and stability studies

本文针对仔猪肠道炎症早期诊断难题，系统开展了粪便生物标志物（LCN-2、MPO、ADA）的分析验证及稳定性研究。通过评估精密度、线性、回收率等参数，证实三种标志物检测方法可靠，并首次揭示LCN-2在粪便中分布不均的特性。研究明确了样本存储条件对标志物稳定性的影响，为标准化肠道健康监测提供关键技术支撑，对减少养殖业抗生素使用具有重要意义。

　　

肠道健康是猪养殖业的核心问题，尤其在仔猪断奶期，肠道炎症常导致腹泻、生长受阻甚至死亡。传统诊断依赖侵入性血液采样，不仅压力大且难以早期预警。粪便样本因获取便捷、无应激优势，成为肠道炎症标志物检测的理想选择。然而，粪便中生物标志物的检测方法缺乏标准化验证，其样本稳定性、分布均匀性等前处理关键问题尚未系统评估，制约了其在兽医临床的推广应用。

为攻克这一难题，巴塞罗那自治大学的研究团队在《Veterinary and Animal Science》发表论文，聚焦脂钙蛋白-2（LCN-2）、髓过氧化物酶（MPO）和腺苷脱氨酶（ADA）三种肠道炎症标志物，系统开展分析方法验证、粪便均质性及存储稳定性研究。研究首次揭示LCN-2在粪便中分布异质性，并明确-80°C冷冻为最优存储条件，为仔猪肠道健康无创监测提供了关键技术规范。

研究采用多农场采集的334份仔猪粪便样本，通过精密度实验（批内/批间变异系数）、稀释线性度、回收率及检测限评估，验证三种标志物检测方法的可靠性。MPO活性测定采用O-联茴香胺氧化法，并利用4-氨基苯甲酰肼（ABAH）抑制实验验证特异性；LCN-2使用猪特异性ELISA试剂盒检测；ADA活性通过酶比色法测定。均质性研究通过对比 homogenized（均质化）与非均质化样本的变异系数（CV）实现；稳定性实验则模拟不同温度（室温、4°C、-20°C、-80°C）下粪便及提取液中标志物的活性变化。

3.1 精密度评估

MPO、LCN-2和ADA的批内变异系数（CV）均低于15%，批间CV除ADA高浓度样本（20.8%）外均控制在16%以下，符合生物分析要求。

3.2 线性度与回收率

三种标志物在系列稀释中均呈现优异线性（R²>0.998）。回收率实验显示MPO（101.0%-106.2%）和ADA（95.6%-108.8%）符合80%-120%标准，LCN-2中浓度样本回收率略低（76.9%），但仍在可接受范围。

3.3 MPO特异性验证

ABAH抑制实验证实粪便中MPO活性特异性，半数抑制浓度（IC₅₀）为7-25 μM，与人类MPO抑制数据一致，排除了其他过氧化物酶干扰。

3.4 标志物均质性分析

fCal、MPO和ADA在均质化与非均质化样本中CV无显著差异（12.1%-18.6%），而LCN-2在非均质化样本中CV高达50.9%，显著高于均质化样本（10.2%），表明其分布不均可能与多种细胞来源有关。

3.5 稳定性研究

粪便样本在-20°C或-80°C冷冻存储时所有标志物稳定性良好；室温或4°C存储24小时后，MPO活性下降28%-31%，ADA下降48%-56%。粪便提取液中，-80°C存储一月后各标志物保持稳定，而-20°C条件下ADA活性损失62%。

研究结论强调，MPO、LCN-2和ADA的检测方法均通过严格验证，适用于仔猪粪便样本分析。fCal、MPO和ADA在粪便中分布均匀，但LCN-2需样本均质化处理。样本长期存储推荐-80°C冷冻条件，以确保标志物完整性。该研究为肠道炎症无创诊断提供了关键方法学支持，尤其在抗生素使用受限的养殖业背景下，对推进动物福利与精准医疗具有重要意义。讨论部分指出，未来需进一步开展生物学验证，建立不同病理条件下的阈值标准，并扩展至不同年龄、遗传背景的猪群评估，以推动粪便标志物的临床标准化应用。