伪激酶pPK4在约氏疟原虫红细胞入侵和出鞭毛中心形成中的关键作用及其机制研究

《Parasitology International》：A pseudokinase pPK4 is required for efficient red blood cell invasion and exflagellation center formation in Plasmodium yoelii

本研究针对疟原虫生命周期中红细胞入侵和有性生殖阶段的关键调控因子尚不明确的问题，聚焦于伪激酶pPK4的功能解析。研究人员利用基因敲除技术，在约氏疟原虫模型中揭示了pPK4在红细胞高效入侵和出鞭毛中心形成中的不可或缺作用。结果表明，pPK4缺失导致寄生虫在小鼠体内增殖能力、毒力及蚊媒传播效率显著下降。该研究为阐明疟原虫致病机制提供了新靶点，对抗疟药物研发具有重要指导意义。

　　

疟疾，这一由疟原虫引起的古老传染病，至今仍是全球面临的重大公共卫生挑战。根据世界卫生组织2024年的报告，2023年全球仍有约2.63亿疟疾病例，并导致59.7万人死亡。在脊椎动物宿主体内，疟原虫通过周期性地入侵红细胞（RBCs）进行增殖。部分无性期寄生虫会在红细胞内发生有性分化，转变为配子体。当雌性按蚊吸血时，配子体被摄入蚊体内，随后雌、雄配子体逸出红细胞并在蚊中肠完成受精过程，开启在蚊体内的发育阶段。因此，深入理解疟原虫在宿主体内的增殖（特别是红细胞入侵）以及在蚊体内有性生殖阶段的分子调控机制，对于开发阻断疟疾传播的新策略至关重要。

伪激酶（Pseudokinase）是一类结构与典型激酶相似，但缺乏催化磷酸化反应能力的蛋白质。在疟原虫中，多种伪激酶在裂殖体（与红细胞入侵相关）和有性阶段（配子体阶段）均表现出高水平的转录本，提示它们可能在这两个生命周期的关键节点扮演着重要角色。研究团队此前已发现一种名为pPK1的伪激酶参与约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）的红细胞入侵和出鞭毛中心（exflagellation center）形成过程。为了更全面地揭示伪激酶家族的功能，本研究将目光投向了另外两个成员：pPK3和pPK4。

为了探究pPK3和pPK4在约氏疟原虫生命周期中的具体功能，研究人员开展了一系列实验。主要关键技术方法包括：利用基因敲除（KO）技术构建pPK3和pPK4的缺陷型寄生虫株，以评估其表型；通过体内红细胞入侵实验分析pPK4-KO寄生虫的入侵能力；采用免疫荧光 assay（IFA）对表达Myc标签pPK4的转基因寄生虫进行蛋白定位研究；通过小鼠模型评估寄生虫的体内生长曲线和毒力；以及通过蚊媒传播实验（计数中肠卵囊数量）评估传播效率。所有实验均使用约氏疟原虫啮齿类模型。

pPK3和pPK4的转录谱特征

研究人员首先分析了pPK3和pPK4的转录模式。结果显示，两者在裂殖体和配子体阶段均具有高转录水平。然而，它们的表达存在性别偏好性：pPK3转录本在雌配子体（macrogametocytes）中比在雄配子体（microgametocytes）中更丰富；而pPK4的表达模式则相反，其在雄配子体中的转录本更为丰富。

pPK4的亚细胞定位

为了解pPK4的功能提供线索，研究人员通过免疫荧光 assay对表达Myc标签pPK4的转基因寄生虫进行了观察。结果表明，pPK4似乎表达于裂殖体和有性阶段（配子体）的细胞质中。

pPK3基因敲除的表型分析

研究人员成功构建了pPK3敲除（pPK3-KO）寄生虫系。令人意外的是，pPK3-KO系在小鼠体内未表现出显著的生长缺陷，并且传播至蚊子后，其形成的卵囊（oocyst）数量也未出现显著减少。这表明pPK3在血液阶段及其后续直至卵囊阶段的寄生虫生命周期发展中并非必需。

pPK4基因敲除的表型分析

与pPK3-KO形成鲜明对比的是，pPK4敲除（pPK4-KO）系表现出显著的表型缺陷。首先，pPK4-KO寄生虫在小鼠体内的生长受到显著影响，其毒力也明显下降。其次，在传播至蚊子后，pPK4-KO系在蚊子中肠形成的卵囊数量显著减少，表明其传播效率受损。

pPK4缺失影响红细胞入侵和出鞭毛中心形成

为了深入探究pPK4-KO表型的内在机制，研究人员进行了专门的功能测定。体内红细胞入侵实验揭示，pPK4-KO系的入侵过程受到影响，但其从宿主细胞逸出（egress）的过程则未受显著影响。在对有性生殖阶段的分析中，虽然pPK4-KO系的配子体血症（gametocytemia）以及雌、雄配子从红细胞中的逸出均无显著差异，但研究人员观察到一个关键现象：出鞭毛中心的数量出现了显著减少。出鞭毛是雄配子体被激活后形成雄配子的过程，出鞭毛中心的形成对于受精至关重要。

本研究系统地表征了约氏疟原虫中的两个伪激酶pPK3和pPK4。研究结论明确指出，pPK4在寄生虫的生命周期中扮演着不可或缺的角色，它对于实现高效的红细胞入侵以及成功的出鞭毛中心形成至关重要。pPK4功能的缺失会直接导致寄生虫在哺乳动物宿主内的增殖能力减弱、毒力降低，并最终削弱其通过蚊媒传播的能力。相比之下，pPK3被证明在血液阶段及后续直至卵囊阶段的发育中并非必需。这些发现不仅深化了我们对伪激酶在疟原虫生物学中功能多样性的理解，更重要的是，鉴定出pPK4这一在关键生命环节（入侵和有性生殖）中起重要作用的分子，为未来开发针对疟原虫红细胞入侵和阻断传播的新型干预策略（如药物或疫苗靶点）提供了有价值的候选靶点。该研究强调了针对寄生虫生命周期中不同节点进行多维度干预的重要性，为抗击疟疾带来了新的见解和希望。