非稳态温度场转鼓发酵器中豆瓣酱霉微生物群的宏基因组学分析：风味形成与AFB1代谢网络解析

《LWT》：Metagenomics analysis reveals flavors formation and AFB 1 metabolic network of doubanjiang-meju microbiota in rotary drum fermenter of Unsteady Temperature Field

本研究针对传统豆瓣酱霉发酵过程中存在的微生物污染、黄曲霉毒素B1(AFB1)威胁及传质传热效率低等问题，创新性地构建了非稳态温度场转鼓发酵器(FRDF)进行豆瓣酱霉发酵。通过宏基因组学技术，研究人员系统比较了FRDF与恒温发酵(FFCT)的差异，发现FRDF能显著提升有机酸、游离氨基酸和挥发性风味物质的含量，有效降低AFB1水平，并揭示了核心微生物群及其代谢网络。该研究为豆瓣酱工业化生产的工艺优化和食品安全控制提供了重要理论依据。

　　

在中国川菜的灵魂——郫县豆瓣的酿造过程中，豆瓣酱霉作为关键中间产物，其品质直接决定了最终产品的风味与安全。然而，传统的开放式发酵方式（如在条池或陶缸中）存在诸多弊端：易受大肠杆菌等杂菌污染，黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的威胁如影随形，生产效率低下，产品质量不稳定，食品安全风险高。虽然封闭式罐式发酵器的应用在一定程度上改善了产品质量，但由于缺乏有效的混合措施，系统内的传质传热效果不佳，限制了其进一步的发展。为了解决这些难题，研究人员将目光投向了在固态发酵中表现出优异传热传质特性的转鼓生物反应器。那么，将转鼓发酵器应用于豆瓣酱霉的发酵，能否破解传统工艺的瓶颈？其中的微生物群落又会发生怎样的变化，从而影响风味形成和毒素降解？这项发表在《LWT》杂志上的研究，通过宏基因组学这一利器，为我们揭开了非稳态温度场转鼓发酵器（FRDF）中豆瓣酱霉微生物群的奥秘。

为了深入探究FRDF的发酵机制，研究团队设计了一项对比实验。他们构建了一套50升的非稳态温度场转鼓发酵系统，通过水浴系统使发酵器内三分之一的酱醅处于40°C环境，其余部分则处于10–22°C的室温，从而形成一个动态的温度场。发酵器每6小时以20转/分钟的速度旋转3分钟，并每4小时以5升/分钟的速率通风5分钟。作为对照，实验设置了在50升罐式发酵器中进行的恒温发酵（FFCT），发酵温度恒定在40°C，通风条件与FRDF相同。实验以从四川郫县豆瓣股份有限公司获得的蚕豆曲为原料，加入0.16 g/mL的盐，在两个过程中分别发酵48天以制备豆瓣酱霉产品。研究人员在发酵的第0、12、24、36和48天，从FRDF和FFCT中无菌采集样品，并储存在-80°C超低温冰箱中备用，用于后续分析。

在技术方法上，本研究主要运用了以下几项关键技术：首先，采用高效液相色谱（HPLC）和全自动氨基酸分析仪分别测定发酵过程中有机酸和游离氨基酸的含量。其次，利用全二维气相色谱-质谱联用（GC/GC-MS）结合气相色谱-嗅闻-质谱（GC-O-MS）技术，对挥发性风味化合物进行定性和定量分析，并计算其气味活性值（OAV）以评估关键风味物质。第三，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的含量。最关键的是，研究团队对采集的样品进行了宏基因组测序：提取微生物群落基因组DNA，构建测序文库，使用Illumina HiSeq平台进行双末端测序。对获得的原始数据进行质量控制和宿主DNA去除后，使用MEGAHIT进行序列组装，并利用Glimmer预测开放阅读框（ORFs）。最后，将预测的基因与NR（非冗余蛋白数据库）、KEGG（京都基因与基因组百科全书）、eggNOG（直系同源蛋白簇进化注释数据库）和CAZy（碳水化合物活性酶数据库）等多个数据库进行比对，完成物种注释、功能基因注释以及代谢通路分析。统计分析和相关性计算则借助SPSS、Origin和OmicShare等工具完成。

3.1. 豆瓣酱霉发酵过程中非挥发性成分分析

3.1.1. 豆瓣酱霉发酵中有机酸的变化

通过对两种工艺中有机酸含量的检测发现，在整个发酵过程中，FRDF和FFCT的总有机酸含量均呈现基本上升趋势，范围分别为3.92–12.04 mg/g和3.92–10.91 mg/g。在六种有机酸中，柠檬酸含量最高，在发酵末期分别占FRDF和FFCT总有机酸含量的0.63（质量分数）和0.56（质量分数）。乳酸是含量第二高的有机酸，但在发酵24天后其含量在两个工艺中均无显著变化，推测可能与后期发酵中乳酸参与形成乳酸乙酯有关。酒石酸、苹果酸和琥珀酸的含量在两个发酵过程间无显著差异。

3.1.2. 豆瓣酱霉发酵中游离氨基酸的变化

研究在两个工艺中共检测到17种游离氨基酸。其含量在发酵初期（前24天）迅速增加，随后增长缓慢，FRDF和FFCT的整体增幅分别为1.60和1.67倍。谷氨酸（Glu）是整个发酵过程中最丰富的氨基酸，其次是赖氨酸、亮氨酸、精氨酸和天冬氨酸。精氨酸含量在两个工艺中均呈现先升高后降低的趋势。两种工艺在游离氨基酸含量上未观察到显著差异。

3.2. 豆瓣酱霉发酵过程挥发性成分的特征

通过GC/GC-MS技术，在整个发酵过程中共检测到164种挥发性物质，分为10类。FRDF在发酵24天和48天时检测到的挥发性物质种类（分别为88和79种）和含量均高于同期的FFCT（分别为77和74种）。值得注意的是，具有烘烤坚果香气的关键香气化合物2,6-二甲基吡嗪仅出现在FRDF中，且其含量随发酵进程逐步增加。此外，1-辛烯-3-醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇、2,3-丁二醇、3-甲硫基丙醛、苯甲醛和2-乙酰基吡咯等风味物质在FRDF中的含量也更高。气味活性值（OAV）分析确定了10种OAV≥1的关键风味物质。其中，芳樟醇、1-辛烯-3-醇、己醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛和异戊酸在FRDF中的OAV始终高于FFCT。

3.3. 两种工艺中黄曲霉毒素B₁的分析

AFB₁含量在两种工艺的整个发酵过程中均呈现波动状态，表明其生成和生物降解在真实系统中同时发生。重要的是，FRDF中的AFB₁含量在整个发酵期间始终显著低于FFCT，在发酵结束时，FRDF中的含量仅为FFCT的三分之一，甚至低于初始含量。

3.4. 宏基因组数据概览

测序共产生12.92亿条原始读长，经严格质量控制后，获得12.80亿条高质量清洁读长。基因预测共识别出3,148,976个开放阅读框（ORFs），基因目录包含512,412个非冗余基因。

3.5. 基于宏基因组学的微生物组成

在属水平上，相对丰度大于0.01的优势菌属包括葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和链球菌属（Streptococcus）等。Staphylococcus是两种工艺中最丰富的属。值得注意的是，作为一种益生菌，四联球菌属（Tetragenococcus）仅在FRDF中从发酵第24天开始出现，其相对丰度从0.0092逐渐增加至发酵结束时的0.85。在种水平上，共获得17个相对丰度大于0.01的物种。Staphylococcus gallinarum在两种工艺中相对丰度最高。Tetragenococcus halophilus仅出现在FRDF过程中，其相对丰度从第24天的0.03增加到发酵结束时的0.08，成为FRDF中第三大优势菌种。

3.6. 微生物功能基因注释

KEGG通路注释显示，与代谢相关的基因相对丰度最高，其中氨基酸代谢和碳水化合物代谢是仅次于全局概览图的最主要通路。eggNOG注释结果与KEGG一致，未知功能（S）、氨基酸转运与代谢（E）以及碳水化合物转运与代谢（G）是富集最多的类别。CAZy数据库注释揭示了微生物群落具有降解淀粉等碳水化合物的巨大潜力，涉及糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）等多种碳水化合物活性酶。

3.7. 微生物与豆瓣酱霉风味的相关性分析

相关性分析表明，在FRDF中，至少有19种风味物质与S. gallinarum、P. acidilactici、B. velezensis等7个物种相关，而在FFCT中仅与10种风味物质相关。此外，FRDF中特有的T. halophilus、S. arlettae等物种也与大多数风味物质相关。仅存在于FRDF中的2,6-二甲基吡嗪与T. halophilus、S. arlettae和B. velezensis呈最强正相关。苯甲醛在FRDF中与10个菌株呈强相关（|P|>0.6），而在FFCT中仅与P. acidilactici相关。关键风味物质与微生物物种在FRDF中表现出比FFCT更强的相关性，表明FRDF中的微生物因更高的传质传热效率和变化的温度而能更好地促进风味形成。

3.8. 与豆瓣酱霉发酵中AFB₁降解相关的代谢途径

通过KEGG数据库注释，获得了两个与AFB₁降解相关的代谢途径。一个途径涉及谷胱甘肽S-转移酶（EC 2.5.1.18），将AFB₁-exo-8,9-环氧化物分解为AFB₁-exo-8,9-环氧化物-GSH。另一个途径涉及微粒体环氧化物水解酶（EC 3.3.2.9）和黄曲霉B₁醛还原酶（AKR7），将环氧化物依次转化为相应的二醇、二醛和二醛醇产物。注释到微粒体环氧化物水解酶（EC 3.3.2.9）的微生物是Bacillus gobiensis，仅出现在FRDF-48样本中。注释到AKR7的物种是Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylolyticus和Lactobacillus delbrueckii，也仅出现在FRDF-48样本中。这表明FRDF中的微生物群落具有降解AFB₁的代谢潜力。

3.9. 与主要风味相关的代谢途径

基于KEGG代谢通路注释，构建了主要风味物质的代谢网络。碳水化合物和蛋白质的降解以及风味的形成主要由Staphylococcus、Pediococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Tetragenococcus及其产生的酶驱动。在碳水化合物代谢中，淀粉和蔗糖被酶解为葡萄糖和丙酮酸，进而代谢为有机酸和挥发性化合物的前体。氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的生物合成来源于原料的蛋白质降解和微生物合成。这些氨基酸通过脱羧和还原反应进一步转化为醛、醇和酯等风味物质。参与上述途径的酶在FRDF中的读长数高于FFCT，表明FRDF中发生了更高水平的微生物活动。特别是，仅FRDF样本中含有Tetragenococcus halophilus，该菌种参与了有机酸和氨基酸的代谢。

综上所述，本研究通过构建非稳态温度场转鼓发酵器（FRDF）进行豆瓣酱霉发酵，并与恒温发酵（FFCT）进行系统比较，结合宏基因组学深度分析，得出明确结论：FRDF在提升产品风味品质和保障食品安全方面具有显著优势。具体表现为能有效提高有机酸、游离氨基酸和挥发性风味物质的含量与多样性，特别是促进了关键香气物质2,6-二甲基吡嗪的生成；同时能显著降低致癌物黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的水平。宏基因组学分析揭示了Staphylococcus gallinarum、Pediococcus acidilactici以及仅在FRDF中出现的Tetragenococcus halophilus等核心微生物群的关键作用，并阐明了它们在风味形成和AFB₁降解中的代谢网络。FRDF的优势归因于非稳态温度场与转鼓混合的协同效应，它动态调节了温度和传质过程，提高了热传导和物质交换效率，从而促进了微生物和酶活性，创造了更均匀、更高效的发酵环境。这项研究不仅为豆瓣酱霉的发酵机制提供了深入的理论见解，也为郫县豆瓣乃至其他传统发酵食品的工业化生产升级、风味品质提升和食品安全控制提供了重要的技术支撑和理论依据，具有显著的学术价值和实际应用前景。