基于pH依赖性双色荧光染料的比率法绝对pH值测定新策略

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：A pH-dependent dual-color fluorescent dye for ratiometric determination of absolute pH value

本文报道了一种新型pH依赖性双色荧光染料，该染料通过双激发/双发射特性实现细胞内pH的比率法精准测量。相比传统染料BCECF和SNARF-1，该染料在弱酸环境下发射绿光，弱碱环境下发射红光，有效规避信号干扰问题，为细胞器微环境pH监测（如溶酶体pH 4.5-5.0、线粒体基质pH 7.7-8.2）提供新工具，对癌症（胞外pH 6.8-7.0）、阿尔茨海默病等疾病的机制研究具有重要价值。

　　

亮点

我们首次合成了一种基于1,6-二羟基萘的羟基半萘荧光素染料，该染料在弱酸性条件下发射绿光，在弱碱性条件下发射红光，展现出独特的pH依赖性双色荧光特性。更重要的是，该染料在中性pH区域附近呈现双激发/双发射功能，其荧光发射比值与pH值呈线性相关，为微环境绝对pH值的精确测定提供了新方案。

材料与方法

4-羟基邻苯二甲酸、1,8-二羟基萘购自BLD pharm（上海）。所有二羟基萘（DHN）异构体（包括1,2-、1,3-、1,4-、1,5-、1,6-、1,7-、2,3-、2,6-、2,7-二羟基萘）均通过标准合成流程与4-羟基邻苯二甲酸缩合，最终成功分离出5种荧光活性产物（产物1-5）。

结果与讨论

通过系统筛选10种二羟基萘衍生物合成的羟基萘荧光素系列，我们发现基于1,6-DHN的羟基半萘荧光素10具有独特的双色荧光行为：其在酸性介质（pH 6.0）中于515 nm处呈现绿色荧光，而在碱性条件（pH 8.0）下于605 nm处发射红色荧光。密度泛函理论计算表明，该染料的荧光转变源于分子内螺环化结构的pH依赖性可逆变化。值得注意的是，双发射峰的强度比值（I₆₀₅/I₅₁₅）在pH 6.5-7.5范围内与pH值呈线性关系，且两种荧光信号互不干扰，显著优于SNARF-1在碱性环境下信号灵敏度衰减的缺陷。

结论

本研究开发的羟基半萘荧光素10首次实现了在生理pH范围内的双色比率法测量，其荧光信号在极端酸碱条件下完全淬灭，有效避免背景干扰。该染料支架为溶酶体酸化和线粒体碱化等细胞过程的研究提供了高精度pH成像工具，在疾病相关微环境监测中具有广阔应用前景。