成熟单增李斯特菌生物膜对消毒剂的耐受性增强及其对绿叶蔬菜供应链的影响

《Journal of Food Protection》：Mature Listeria monocytogenes biofilms exhibit reduced susceptibility to sanitizers – relevance to the (leafy green) fresh food supply chain

本研究针对新鲜食品供应链中单增李斯特菌生物膜难以清除的问题，系统评估了氯和过氧乙酸在不同温度下对成熟生物膜的杀灭效果。研究发现，即使使用高浓度消毒剂(氯达300 ppm，过氧乙酸达500 ppm)，仍无法有效清除不锈钢表面形成的成熟生物膜，强调了在食品加工环境中加强清洁消毒和维持冷链的重要性。

　　

在当今追求健康饮食的潮流中，新鲜沙拉和草本植物已成为餐桌上的常客。然而这些看似洁净的即食食品，从田间到餐桌的旅程中却暗藏危机。特别是在加工和包装环节，它们可能暴露于食源性致病菌的环境污染中。其中，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)尤为令人担忧——这种革兰氏阳性兼性厌氧菌在自然界中无处不在，能够在冷藏温度、低氧和低营养条件下生存和繁殖，正是这些特性使其成为新鲜食品供应链中的顽固难题。

感染单增李斯特菌可能导致李斯特菌病，对免疫功能低下者、孕妇、新生儿和老年人可能致命。更棘手的是，这种细菌能够形成生物膜(biofilm)——一种附着于表面的复杂三维细菌群落，被自身产生的胞外聚合物(EPS)基质包裹。这种生物膜结构为细菌提供了保护伞，使其能够抵抗消毒剂的杀灭作用。在新鲜食品加工厂中，单增李斯特菌生物膜可能持续存在数年，导致反复污染事件。氧化剂如氯和过氧乙酸(PAA)因成本较低且对新鲜农产品质量影响小，常被用于食品加工厂的消毒过程，但它们对单增李斯特菌生物膜的处理效果却不稳定。

为了深入探究这一问题，由Lucy Sutton、Megan Humphreys、Callum Highmore、Sandra Wilks和Charles William Keevil组成的研究团队在《Journal of Food Protection》上发表了一项重要研究，系统评估了常用消毒剂对单增李斯特菌生物膜的杀灭效果，并考虑了生物膜成熟度和生长温度的影响因素。

研究团队采用了多种关键技术方法开展实验。他们选择了三种具有代表性的李斯特菌菌株：单增李斯特菌Scott A(血清型4b，高致病性)、单增李斯特菌CECT 936(血清型1/2b，临床参考菌株)和无毒力的英诺克李斯特菌(L. innocua)NCTC 12210。生物膜在不锈钢片(1 cm²)上培养7天，温度设置为20°C(室温)和4°C(冷藏温度)，模拟食品加工环境中的温度波动。消毒处理在生物膜培养的第1、3、5和7天进行，使用氯(最高300 ppm)和过氧乙酸(最高500 ppm)两种消毒剂，处理10分钟后用硫代硫酸钠中和。通过菌落形成单位(CFU)计数评估消毒效果，并使用活/死细菌染色结合显微镜技术观察生物膜结构。

生物膜生长特性

研究结果显示，三种李斯特菌在20°C下均能形成稳定的生物膜，培养3天后菌量超过7 log₁₀ CFU/cm²，并在第5天和第7天保持稳定。而在4°C条件下形成的生物膜菌量显著较低，比20°C条件下低约3个对数单位，凸显了维持冷链对控制微生物生长的重要性。显微镜观察进一步证实，20°C下形成的生物膜更密集、更厚，而4°C下的生物膜细胞稀疏。

消毒剂对生物膜的效果

研究发现，李斯特菌形成生物膜后对氯和过氧乙酸的耐受性显著增强。浮游状态的李斯特菌可被低浓度消毒剂完全杀灭(25-50 ppm氯或过氧乙酸)，但生物膜状态下的细菌即使暴露于高浓度消毒剂(300 ppm氯或500 ppm过氧乙酸)仍能存活。生物膜成熟度影响消毒效果——培养1天的生物膜对消毒剂较为敏感，而培养3天及以上的成熟生物膜表现出更强的耐受性。温度也影响消毒效果，4°C下培养的年轻生物膜(1天)对消毒剂敏感，但成熟后(5天和7天)同样表现出耐受性。

显微镜观察结果

活/死细菌染色显示，随着消毒剂浓度增加，红色荧光(死细胞标记)增多，但与培养计数结果存在差异。研究人员认为这可能是因为染色剂中的碘化丙啶(PI)不仅能与死细胞DNA结合，也能与生物膜胞外聚合物中的细胞外DNA(eDNA)结合，导致对死细胞数量的高估。显微镜图像还显示，李斯特菌倾向于附着在不锈钢表面的裂缝和凹陷处，这种表面拓扑结构可能为细菌提供物理保护，增加清洁难度。

研究表明，单增李斯特菌生物膜对常用消毒剂具有显著耐受性，这种耐受性随生物膜成熟度增加而增强。生物膜的胞外聚合物基质可能通过物理阻挡、消毒剂淬灭和促进应激基因表达等机制提供保护。研究还发现，无毒力的英诺克李斯特菌也能形成具有保护性基质的生物膜，在混合菌生物膜中可能保护致病菌株免受消毒剂杀灭。

这项研究对食品安全生产具有重要意义。它揭示了单纯依赖化学消毒剂处理成熟生物膜的局限性，强调了在食品加工环境中需要采取综合清洁策略的重要性，包括机械清洁(物理破坏生物膜)与化学消毒相结合，并保持严格的温度控制。研究结果为指导食品加工厂的卫生实践提供了科学依据，对减少食源性疾病暴发具有重要应用价值。

该研究的发现提醒食品行业，预防生物膜形成比清除已建立的生物膜更为重要。定期、彻底的清洁消毒程序，结合环境监测和温度控制，是确保新鲜食品安全的关键措施。未来的研究可进一步探索混合菌生物膜中微生物互作对消毒剂耐受性的影响，以及开发更有效的生物膜控制策略。