通过单次切向流过滤结合亲和层析法进行AAV（腺相关病毒）纯化的下游工艺强化

《Biotechnology and Bioengineering》：Downstream Process Intensification for AAV Purification by Affinity Chromatography Using Single Pass Tangential Flow Filtration

本研究开发了两种基于单次通量过滤（SPTFF）的强化腺相关病毒（AAV）下游生产工艺，分别在实验室和半工业规模验证。通过SPTFF将AAV浓度提高12倍，纯化步骤耗时减少80%，同时实现高病毒收率（>99%）和杂质去除率（HCP去除48%，DNA去除37%）。集成工艺使总操作时间缩短81%，树脂利用率提升36%，成本降低10%，整体生产力提高8.5倍。该方法为AAV制造向连续化生产转型提供了技术基础。

　　在基因治疗领域，腺相关病毒载体（AAV）因其安全性、高效性和广泛的适用性，已经成为一个关键的平台。然而，尽管AAV具有显著的治疗潜力，其高昂的生产成本却极大地限制了患者的可及性，单次治疗费用可能高达350万美元。这些成本的高昂部分源于制造过程中的瓶颈，包括高设施和消耗品成本、低产品收率以及较长的制造时间。因此，优化和提升AAV的下游加工过程，使其更加高效、经济，成为当前研究的重点。

本研究旨在探索两种不同的强化AAV下游制造流程，分别在实验室规模和中试规模进行。通过引入先进的澄清方法和单次通过切向流过滤（SPTFF）技术，研究人员希望提升AAV的收率，同时减少杂质含量。实验室规模的澄清过程采用BioOptimal? MF-SL切向流微滤器，该设备能够连续去除细胞碎片，同时结合阴离子交换膜吸附器进一步去除宿主细胞蛋白（HCP）和DNA。中试规模则使用了传统的Clarisolve?深度过滤设备，随后通过Cadence?模块化过滤器进行多膜阶段的SPTFF处理，以浓缩较大体积的AAV澄清液。

在实验室规模中，SPTFF使用两个Pellicon XL50 cassette，每组配备100 kDa再生纤维素膜。通过调整流速，研究人员实现了12倍的体积浓缩（VCF），并且AAV收率超过了99%。在中试规模中，使用了十五个Centramate? T02 cassette，每个cassette配备100 kDa PES膜，提供总膜面积0.279平方米。这种多阶段配置使得SPTFF能够在不重复使用的情况下处理更大的体积，并且在处理结束后，通过缓冲液冲洗回收部分AAV，进一步提升收率。SPTFF的使用不仅提高了AAV的收率，还显著减少了操作时间，从而提升了整体的生产效率。

随后，AAV澄清液进入亲和层析步骤，以进一步去除残留的HCP和DNA。实验室规模的亲和层析使用POROS? GoPure? AAVX预装柱，与?KTA? Pure系统连接。通过比较不同批次的实验数据，研究人员发现SPTFF预浓缩能够显著缩短亲和层析的装载时间，同时提高树脂的利用率。此外，SPTFF预浓缩还能够提升亲和层析的收率，因为其提高了AAV的浓度，使得树脂能够更有效地结合目标产物。在中试规模中，使用了AVB Sepharose High Performance（HP）树脂，通过Omnifit? EZ柱进行亲和层析，同样实现了显著的收率提升。

通过整合澄清、SPTFF和亲和层析步骤，研究人员设计了一个中试规模的集成流程，进一步提升了整体的生产效率。该流程实现了81%的操作时间减少和36%的树脂利用率提升，同时预计降低了约10%的原材料成本。从技术经济分析来看，这种集成流程能够显著降低整体成本，使AAV基因治疗更加经济可行。

在实验室规模中，SPTFF的使用使得AAV的收率达到了99%以上，同时减少了杂质的含量。此外，通过缓冲液冲洗，研究人员能够回收部分AAV，进一步提升收率。中试规模的SPTFF则通过多阶段的配置，实现了更高的体积浓缩，同时保持了较高的AAV收率。这些实验结果表明，SPTFF在AAV制造过程中具有显著的提升作用，能够减少操作时间，提高收率，并降低生产成本。

尽管SPTFF在AAV制造中的应用仍处于初步阶段，但其在提升生产效率方面的潜力已经得到验证。未来的研究可以进一步优化SPTFF的参数，例如使用更大孔径的膜材料，以提高流速和杂质去除率。此外，SPTFF模块的清洗和验证也能够显著降低其成本，从而提升整个制造过程的经济性。这些改进将有助于推动AAV基因治疗从实验室走向大规模生产，使更多的患者能够负担得起这种治疗手段。