豌豆（Pisum sativum L.）营养性状的全基因组关联研究及其在生物强化中的应用

《The Plant Genome》：Genome-wide association studies of nutritional traits in peas (Pisum sativum L.) for biofortification

本研究对来自59个国家的267个豌豆样本进行表型和基因组分析，发现染色体5的基因组热点区域与蛋白质含量和硫氨基酸（SAA）显著相关，涉及10个候选基因。通过GWAS分析鉴定了17个标记-性状关联（MTA），其中7个与蛋白质和SAA相关，并揭示了遗传多样性及环境适应性的关联。这些成果为培育高营养豌豆品种提供了遗传靶点。

　　本研究聚焦于豌豆（*Pisum sativum* L.）这一高营养、适合凉爽气候的豆科作物，旨在通过基因组辅助育种提升其营养价值和品质。豌豆作为植物性蛋白质的重要来源，正逐渐成为可持续农业和植物性食品体系中的关键组成部分。随着人们对替代蛋白质来源的需求日益增长，豌豆的营养价值和种植可持续性得到了越来越多的关注。尽管其营养成分丰富，但其在农业育种中的研究仍相对有限，尤其是对关键营养性状的遗传基础的探索。

本研究对来自美国农业部（USDA）豌豆单株加种质资源库（PSPPC）的267个种质资源进行了为期三年的评估，这些资源来自59个国家，分别在南卡罗来纳州的两个USDA认证有机农场进行种植和测试。研究的主要目标包括评估表型变异、表征种群结构与起源，以及通过54,316个单核苷酸多态性（SNP）标记进行全基因组关联分析（GWAS），以分析五种关键营养性状：蛋白质浓度、含硫氨基酸（SAAs）、膳食纤维、总淀粉含量以及蛋白质消化率（PDg）。通过使用ADMIXTURE和主成分分析（PCA）进行种群结构分析，研究人员识别出了10个祖先亚种群，这表明种质资源中存在显著的遗传多样性。GWAS分析发现了与蛋白质、SAAs和PDg相关的17个标记-性状关联（MTA），其中染色体5的近端区域表现出一个基因组热点，与蛋白质和SAAs的积累有关。这一区域中包含多个候选基因，这些基因可能参与种子发育、发芽和蛋白质生物合成过程，为蛋白质和SAAs的遗传调控提供了新的线索。

在实验设计方面，研究人员在三年内（2020、2021和2022）对297个种质资源进行了田间评估，其中部分种质资源未进行基因型分析，而另外两个商业品种AAC Carver和CDC Inca则被纳入评估范围。实验采用随机完全区组设计，每块田地进行三到两轮重复种植，以确保数据的可靠性。在不同试验地点，研究人员采用了不同的田间布局和种植密度，以反映实际种植条件下的遗传表现。所有试验均遵循有机农业标准，未使用任何化学肥料或灌溉，以确保结果与有机生产环境下的真实情况一致。试验过程中，豌豆荚被手工采摘，晾晒干燥后通过Almaco Belt Thresher进行脱粒，最终获得种子样本用于营养成分分析。

在表型分析方面，研究人员利用傅里叶变换中红外光谱仪（FT-MIR）测量了五种关键营养性状，包括总蛋白质、SAAs、膳食纤维、总淀粉和PDg。每种性状的测量都基于100次扫描，并通过背景扫描和校正程序确保数据的准确性。通过构建部分最小二乘模型（PLS），研究人员能够从光谱数据中预测性状值。同时，为了减少样本交叉污染，所有样本在测量前均使用高纯度甲醇清洁光谱仪的ATR晶体。通过对表型数据进行统计分析，研究人员发现不同环境下的性状表现存在显著差异，但整体上表现出一定的遗传稳定性。此外，通过PCA分析，研究人员能够揭示不同种质资源之间的遗传关系，并利用BLUP（最佳线性无偏预测）方法对性状值进行标准化处理，以提高后续分析的准确性。

在基因型分析方面，研究人员使用VCFtools和TASSEL等工具对PSPPC种质资源进行了SNP筛选和过滤，最终获得了54,315个高质量的SNP标记。这些标记用于构建基因型矩阵，并进一步生成LD（连锁不平衡）块。LD块的确定基于相邻SNP之间的相关性，以识别潜在的基因调控区域。此外，通过计算平均核苷酸多样性（π）和Tajima's D统计量，研究人员评估了种质资源的遗传多样性，发现其整体遗传多样性较高，这为后续的基因组辅助育种提供了丰富的遗传资源。异质性分析也表明，种质资源在基因组层面表现出较高的遗传变异，这对提升种质资源的遗传潜力至关重要。

全基因组关联分析（GWAS）揭示了与蛋白质、SAAs和PDg相关的多个标记-性状关联。其中，染色体5的近端区域表现出显著的关联性，这一区域包含了多个候选基因，这些基因可能在种子蛋白质和含硫氨基酸的积累过程中起关键作用。此外，研究人员还发现了一些与蛋白质和SAAs相关的基因，如蛋白磷酸酶2C（PP2C）、APETALA2（AP2）结构域蛋白、eIF2A、BRCT结构域蛋白和dicer结构域蛋白等。这些基因可能通过不同的生物学途径影响种子的营养性状，例如调控种子发育、蛋白质合成和代谢过程。然而，目前对这些基因在豌豆中的具体功能仍缺乏充分的验证，因此需要进一步的功能研究以明确其在蛋白质和含硫氨基酸积累中的作用机制。

研究还发现，蛋白质含量与膳食纤维和PDg之间存在显著的正相关性，这表明在育种过程中，提高蛋白质含量可能会同时提升纤维和消化率。然而，SAAs与其他性状之间没有显著关联，这提示需要独立的育种策略来提高SAAs含量，同时确保种子的整体品质不受影响。为了解决这一问题，研究人员提出采用选择指数方法，以实现对多个性状的协同改良。此外，研究还指出，种质资源中存在多个潜在的基因组热点，这些区域可能成为未来基因组辅助育种的重点目标。

本研究的发现不仅揭示了豌豆营养性状的遗传基础，还为育种实践提供了重要的基因靶点。例如，染色体5的近端区域表现出与蛋白质和SAAs高度相关的基因组热点，这一区域的遗传信息可用于构建更高效的育种方案。同时，研究还强调了种质资源多样性在农业育种中的重要性，特别是PSPPC种质资源的广泛应用，为豌豆的遗传改良提供了丰富的基因组资源。通过整合代谢组学和蛋白质组学数据，研究人员可以更全面地理解这些基因在种子发育和营养积累中的作用，从而推动豌豆作为植物性食品的重要组成部分的发展。

此外，研究还强调了有机农业在提高豌豆营养价值方面的潜力。与传统农业相比，有机种植方式能够减少化学投入，提高土壤质量和生物多样性，同时对环境的负面影响较小。这表明，通过有机农业手段种植的豌豆可能具有更高的营养价值和更广泛的环境适应性，这为未来在可持续农业体系中推广豌豆种植提供了理论依据。研究人员指出，随着全球对植物性食品的需求增加，豌豆作为高蛋白、高纤维的作物，其营养价值的进一步提升将有助于满足人们的健康需求，同时促进农业的可持续发展。

最后，研究结果对豌豆育种实践具有重要的指导意义。通过识别关键的基因组区域和候选基因，研究人员为未来利用分子标记辅助选择（MAS）和基因组选择（GS）技术改良豌豆提供了基础。这些技术可以有效利用种质资源中的遗传多样性，提高育种效率，从而开发出更高品质、更具营养价值的豌豆品种。此外，研究还提出，未来可以通过进一步的功能研究、精细定位和基因挖掘，探索这些基因在豌豆中的具体作用机制，为豌豆的营养性状改良提供更精准的遗传依据。总之，本研究不仅揭示了豌豆营养性状的遗传基础，还为推动豌豆作为可持续植物性蛋白来源的进一步发展提供了坚实的科学基础。