miR-483-3p通过调控BCLAF1/PUMA/BAK1凋亡网络成为前列腺癌治疗新靶点

《Cell Death & Disease》：A microRNA CRISPR screen reveals microRNA-483-3p as an apoptotic regulator in prostate cancer cells

本研究针对前列腺癌(PCa)治疗中凋亡逃逸的临床挑战，开发了新一代miRNA专用CRISPR敲除库miRKOv2，通过全基因组功能缺失筛选发现miR-483-3p是维持PCa细胞存活的关键调控因子。机制研究揭示miR-483-3p通过直接靶向BCLAF1/PUMA/BAK1凋亡信号网络抑制内在凋亡通路，其抑制剂与多西他赛(DTX)联用可显著增强化疗效果。该研究为转移性PCa提供了新的治疗策略，发表于《Cell Death and Disease》(2025)。

　　

前列腺癌作为全球男性第二高发恶性肿瘤，每年导致近40万人死亡，尤其转移性前列腺癌仍是临床治疗的难点。传统蛋白靶向疗法的开发周期长达数十年，而基于microRNA(miRNA)的疗法因其序列特异性结合优势和调控多通路能力展现出巨大潜力。然而由于缺乏高效的筛选工具， miRNA在前列腺癌中的具体功能机制研究进展缓慢。

在这项发表于《Cell Death and Disease》的研究中，多伦多大学Leonardo Salmena团队开发了新一代miRNA专用CRISPR敲除库miRKOv2，通过对DU145和LNCaP前列腺癌细胞进行全基因组筛选，发现70个潜在必需miRNA，其中miR-483对细胞存活影响最为显著。功能验证表明miR-483敲除通过激活内在凋亡通路显著抑制癌细胞生长，而机制研究揭示miR-483-3p通过直接调控BCLAF1/PUMA/BAK1凋亡网络发挥关键作用。更重要的是，miR-483-3p特异性抑制剂与多西他赛联用产生协同抗肿瘤效应，为转移性前列腺癌提供了新的治疗策略。

研究人员主要采用四大技术方法：1）新型miRKOv2 CRISPR库设计与全基因组筛选；2）双gRNA敲除(DKO)系统验证基因功能；3）流式细胞术检测凋亡与线粒体膜电位(JC-1)；4）双荧光素酶报告基因验证靶向关系。此外整合了CPC-GENE患者数据集和ENCODE公共数据库进行生物信息学分析。

生成miRKOv2及其在前列腺癌细胞中筛选必需miRNA

研究团队开发的miRKOv2库包含6532条gRNA，靶向1649个pre-miRNA茎环区域，相比现有库具有更优的靶向效率和更低的脱靶效应。在DU145和LNCaP细胞中进行27-30天脱落筛选，通过BAGEL算法鉴定出70个必需miRNA候选物，其中miR-483表现出最显著的细胞活力影响。

MIR483是前列腺癌细胞生长所必需的

通过独立gRNA和双gRNA敲除系统验证，发现miR-483敲除在DU145、LNCaP、PC3和22Rv1等多种前列腺癌细胞中均抑制生长，但在良性前列腺上皮细胞RWPE-1中无影响，表明其必需性具有癌特异性。TIDE分析证实DKO系统成功删除40-45核苷酸片段，且不影响宿主基因IGF2表达。

miR-483靶向凋亡通路且其敲除增加前列腺癌细胞凋亡

PathDIP和GSEA分析显示miR-483与凋亡通路显著相关。实验证实miR-483敲除导致Annexin V/7AAD阳性细胞增加，caspase-3/9活性升高，线粒体膜电位下降，表明其通过调控线粒体稳态介导内在凋亡通路。

miR-483-3p靶向BCLAF1/PUMA/BAK1信号通路抑制内在凋亡

通过mirDIP筛选发现72个miR-483-3p靶基因与线粒体外膜透化(MOMP)相关，其中包含7个Bcl-2家族成员。实验验证PUMA和BAK1在敲除模型中表达上调，双荧光素酶报告基因证实PUMA是直接靶点。有趣的是，BAK1虽被去抑制但非直接靶点，进一步通过ENCODE ChIP-seq数据发现BCLAF1可转录调控BAK1和PUMA。实验证实BCLAF1是miR-483-3p直接靶点，且其敲除选择性下调BAK1而非PUMA，揭示miR-483-3p通过BCLAF1/PUMA/BAK1网络层级调控凋亡。

miR-483-3p抑制增强多西他赛疗效

使用Tough Decoy(TD)特异性抑制miR-483-3p可显著抑制PC3细胞生长，且与多西他赛联用产生叠加效应。协同分析显示特定剂量组合(1μg TD+0.1nM DTX)具有协同作用，表明miR-483-3p抑制可提高化疗药物敏感性。

miR-483过表达在癌前细胞中促进生长但在前列腺癌细胞中不敏感

在DU145细胞中过表达miR-483未促进生长但诱导DTX耐药，而在RWPE-1癌前细胞中过表达显著促进增殖并诱导DTX抵抗，提示miR-483在恶性转化前后发挥不同功能。

该研究通过创新性筛选工具揭示了miR-483-3p在前列腺癌中的关键作用，挑战了miRNA仅作为基因表达微调器的传统认知。发现的miR-483-3p/BCLAF1/PUMA/BAK1调控网络为理解癌细胞凋亡逃逸提供了新视角，其癌特异性必需性和化疗增敏效应使其成为极具前景的治疗靶点。这项研究不仅为转移性前列腺癌提供了新的治疗策略，也为miRNA功能研究建立了可靠的技术平台。