基于AHL群体感应系统调控原料奶中假单胞菌蛋白水解活性的机制及多酚抑制策略研究

《International Journal of Food Microbiology》：Characterization of AHL-mediated quorum sensing in Pseudomonas gessardii from raw milk and insights into control of proteolytic activity

本研究针对冷藏原料奶中假单胞菌通过群体感应（QS）调控耐热蛋白酶分泌的行业难题，通过表征Pseudomonas gessardii的AHL-QS系统并筛选多酚类抑制剂，发现C4-HSL为关键信号分子，水杨酸（SA）和肉桂醛（CIN）可通过竞争性结合LuxR受体抑制10–60%的蛋白酶活性，为乳制品冷链保鲜提供了新型靶向控制策略。

　　

在乳制品工业中，原料奶的冷藏储存环节常面临 psychrotrophic（嗜冷）细菌污染的重大挑战。这类细菌能在4°C低温环境下持续增殖，并分泌耐热蛋白酶，即使经过后续巴氏杀菌处理，酶活性仍可导致产品出现苦味、凝胶化等变质现象。其中，Pseudomonas（假单胞菌）属细菌被认为是主要的污染菌群，其通过群体感应（Quorum Sensing, QS）机制调控致腐因子的表达。当细菌密度达到临界值时，它们会合成并释放自诱导剂（如酰基高丝氨酸内酯类AHLs），与转录调控蛋白（如LuxR型受体）结合后激活蛋白酶等毒力因子基因的转录。因此，干扰AHL介导的QS通路被视为控制乳制品腐败的创新突破口。

为破解这一难题，Mohammed Kamal Salman等人在《International Journal of Food Microbiology》发表的研究中，从原料奶分离出6株高蛋白水解活性的Pseudomonas gessardii，通过MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和16S rRNA测序完成菌种鉴定。研究团队综合利用生物报告菌株、薄层色谱覆盖分析（TLC-overlay）和超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术，系统解析了该菌的QS系统特征；进一步选取水杨酸（SA）、肉桂醛（CIN）和单宁酸（TA）作为QS抑制剂（QSIs），通过分子对接模拟和蛋白酶活性实验，验证了多酚物质通过竞争性抑制AHL与LuxR结合的作用机制。

关键技术方法概述

研究以原料奶分离的Pseudomonas gessardii为对象，通过MALDI-TOF MS和16S rRNA测序进行菌种鉴定；采用Chromobacterium violaceum CV026和Agrobacterium tumefaciens A136等报告菌株进行AHL活性初筛；结合TLC-overlay和UPLC-MS精确鉴定信号分子类型；通过分子对接模拟分析QSIs与LuxR受体的相互作用；最后在4°C和25°C下测定蛋白酶活性抑制率。

QS信号分子鉴定

通过TLC-overlay和UPLC-MS分析，明确P. gessardii主要产生短链信号分子C4-HSL（N-丁酰高丝氨酸内酯），且其产量与细菌密度正相关。报告菌株实验显示AHL活性在培养后期（24-48小时）显著增强，证实QS系统在低温环境下仍可有效激活。

多酚类QS抑制剂的筛选与机制验证

蛋白酶活性测定表明，SA和CIN在亚抑制浓度下对4°C和25°C的蛋白酶活性分别产生15–58%和10–60%的抑制效果，且无抗菌作用，说明其特异性作用于QS通路。分子对接显示SA和CIN可通过氢键和疏水作用竞争性占据LuxR受体的AHL结合位点，阻断天然信号分子触发基因表达。

温度对抑制效果的影响

低温（4°C）环境下SA的抑制率普遍高于CIN，而在25°C时CIN表现出更强抑制潜力。这一差异与抑制剂分子在不同温度下与受体的结合稳定性有关，提示实际应用中需根据储存温度优化抑制剂选择。

研究结论与意义

本研究发现P. gessardii通过C4-HSL介导的QS系统调控蛋白酶合成，而多酚类物质可通过分子竞争机制有效阻断该通路。该策略不仅为乳制品行业提供了针对psychrotrophic Pseudomonas的新型生物防腐方案，还拓展了QS抑制剂在食品保鲜领域的应用场景。由于抑制剂不具抗菌性，可减缓细菌耐药性产生，对保障乳品安全及延长货架期具有重要实践价值。