抗菌肽KRR-N1-5W6L与百里香酚协同灭活冷藏牛肉中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其保鲜作用研究

《International Journal of Food Microbiology》：Synergistic effects of antimicrobial peptide KRR-N1-5W6L and thymol on the inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in chilled beef

本研究针对冷藏牛肉中MRSA污染控制难题，探索了抗菌肽KN5与四种天然化合物的协同抗菌效果。研究发现KN5与THY组合具有强协同作用（FICI=0.375），能协同破坏细胞结构完整性、耗散质子动力、增强ROS生成和DNA结合活性，并在牛肉保鲜中有效抑制微生物增殖且不影响感官品质，为食品保鲜提供了新策略。

　　

在食品工业中，微生物污染，特别是由耐药菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA）引起的污染，一直是威胁食品安全和缩短货架期的主要挑战。传统的化学防腐剂可能带来残留和耐药性等问题，而单一使用天然抗菌剂又往往需要较高浓度才能达到效果，这可能会影响食品的感官品质。因此，寻找高效、安全且能协同作用的抗菌组合策略，成为食品保鲜领域的研究热点。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其独特的抗菌机制和不易诱导耐药性而备受关注，而天然植物精油成分如百里香酚（Thymol, THY）等也显示出良好的抗菌活性。将两者结合，探索其协同效应，有望为控制食品中病原微生物提供新的解决方案。本研究旨在探究抗菌肽KRR-N1-5W6L（KN5）与几种天然化合物对MRSA的协同抗菌效果及其在冷藏牛肉保鲜中的应用潜力。相关研究成果发表在《International Journal of Food Microbiology》上。

为开展本研究，研究人员主要应用了几项关键技术方法。研究以MRSA菌株为实验对象，样本队列为实验室标准菌株。首先，通过棋盘法稀释实验计算分级抑菌浓度指数（Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI）来评价KN5与四种天然化合物（THY、丁香酚、柠檬醛、肉桂醛）的协同作用。其次，通过时间-杀菌曲线评估组合的杀菌动力学。在机制探究方面，采用了一系列生化分析技术：通过检测碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）、核酸和蛋白质的泄漏来评估细胞膜完整性；通过测量膜电位和pH梯度来评估质子动力（Proton Motive Force, PMF）的耗竭；通过荧光探针法检测活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的生成；并通过凝胶阻滞实验分析KN5与DNA的结合亲和力。最后，通过将KN5与THY联合处理应用于冷藏牛肉样品，监测其微生物数量、pH值、硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric Acid Reactive Substances, TBARS）值、颜色变化和感官品质，以评估其实际保鲜效果。

协同抗菌作用的筛选

研究人员首先评估了抗菌肽KN5分别与百里香酚（THY）、丁香酚、柠檬醛和肉桂醛组合对MRSA的抑菌效果。结果表明，在所有测试的组合中，只有KN5与THY的组合表现出强烈的协同抗菌作用，其分级抑菌浓度指数（FICI）为0.375（FICI ≤ 0.5通常被认为具有协同作用）。而KN5与其他三种化合物的组合则表现为相加或无关作用。这一发现为后续深入研究KN5与THY的协同机制及其应用提供了依据。

协同杀菌动力学分析

为了验证协同作用的动态效果，研究进行了时间-杀菌曲线实验。结果显示，与单独使用KN5或THY相比，KN5与THY联合使用时，能在更短的时间内显著降低MRSA的活菌数，表现出快速且增强的杀菌能力。这表明两者的组合不仅抑制细菌生长，更能有效杀灭细菌，具有实际应用于食品杀菌的潜力。

对细胞结构完整性的影响

抗菌机制研究首先聚焦于细胞膜和细胞壁的完整性。研究人员通过检测细胞内物质的外泄来评估膜损伤程度。研究发现，KN5与THY联合处理导致了MRSA细胞内核苷酸和蛋白质的大量泄漏，同时，标志细胞壁损伤的碱性磷酸酶（AKP）泄漏量也显著增加。这些结果强有力地证明，KN5和THY能够协同破坏MRSA细胞的细胞壁和细胞膜结构完整性，导致细胞内含物外流，从而引起细胞死亡。

对质子动力（PMF）的耗竭作用

质子动力（PMF）是细菌细胞膜两侧的电化学梯度，为许多生命活动提供能量。本研究通过测量膜电位（Δψ）和pH梯度（ΔpH）来评估PMF的变化。结果表明，KN5和THY单独处理均能引起一定程度的PMF下降，但两者联合处理时，对PMF的耗竭作用显著增强，表现为Δψ和ΔpH的急剧降低。PMF的耗竭会严重影响细菌的能量代谢和物质运输，这也是导致细菌死亡的重要机制之一。

对活性氧（ROS）生成和DNA结合的增强效应

除了膜损伤，研究还探讨了氧化应激和遗传物质损伤机制。实验发现，KN5能够诱导MRSA细胞内活性氧（ROS）的积累，而THY本身并不直接诱导显著的ROS产生。然而，当THY与KN5联合使用时，THY能够显著增强KN5诱导的ROS生成水平。过量的ROS会氧化损伤细胞内的蛋白质、脂质和DNA等大分子。此外，通过凝胶阻滞实验分析KN5与细菌DNA的结合情况，发现THY的存在增强了KN5与DNA的结合亲和力。这表明，协同作用可能通过加剧氧化损伤和干扰DNA功能共同导致细胞死亡。

在冷藏牛肉保鲜中的应用效果

将上述体外研究的发现应用于实际食品体系，研究人员评估了KN5与THY组合对冷藏牛肉的保鲜效果。结果表明，该组合能有效抑制牛肉中微生物（包括MRSA）的生长繁殖，延缓了在冷藏过程中由于微生物活动导致的pH值上升、脂肪氧化（表现为TBARS值升高）以及肉色的劣变（如褐变）。更重要的是，经过处理的牛肉样品在感官品质（如气味、色泽、质地）上与未处理组或无显著差异，说明该组合在有效抗菌的同时，不影响牛肉的食用品质。

本研究系统阐明了抗菌肽KRR-N1-5W6L（KN5）与百里香酚（THY）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的协同抗菌作用及机制。研究表明，KN5与THY的组合通过协同破坏细胞结构完整性、耗竭质子动力（PMF）、增强活性氧（ROS）生成和促进抗菌肽与DNA结合等多种途径，实现了高效杀菌。在实际应用层面，该组合能有效抑制冷藏牛肉中的微生物增殖，延缓品质劣变，且不影响感官特性。这项工作不仅为理解抗菌肽与植物源化合物的协同作用机制提供了新的见解，而且为开发安全、高效的天然食品保鲜剂组合以控制食源性病原体、保障食品安全和延长货架期提供了有前景的策略。这种基于协同效应的抗菌方法，有望减少单一抗菌剂的使用量，从而降低潜在毒性和耐药性风险，具有重要的理论价值和实际应用意义。