通过血小板特异性FVIII慢病毒载体骨髓内注射治疗犬血友病A的基因疗法研究

《Blood Vessels, Thrombosis & Hemostasis》：Treatment of Canine Hemophilia A via Intraosseous Delivery of a Platelet-Specific Factor VIII-Lentiviral Vector

本研究针对血友病A（HemA）传统蛋白输注疗法成本高、需反复给药等问题，开展了通过骨髓内（IO）递送血小板特异性FVIII慢病毒载体（Gp1bα-G-cF8-LV）的基因治疗研究。结果表明该策略能在HemA犬模型中实现血小板内FVIII的长期稳定表达，显著改善凝血功能、减少出血事件，且安全性良好，为临床转化提供了重要依据。

　　

血友病A（Hemophilia A, HemA）是一种由于凝血因子VIII（FVIII）基因缺陷导致的X染色体连锁隐性遗传出血性疾病。患者由于血液中FVIII缺乏，凝血 cascade（级联反应）受阻，从而表现出终身性的自发性或创伤后出血倾向，特别是关节和肌肉的反复出血，可导致慢性疼痛、关节畸形甚至残疾，严重影响生活质量。长期以来，HemA的标准治疗方案是定期输注外源性FVIII浓缩制剂（蛋白替代疗法）。然而，这种疗法存在显著局限性：FVIII半衰期短，需要频繁静脉输注（通常每周2-3次），给患者及其家庭带来极大的不便和经济负担；部分患者会产生FVIII抑制物（抗体），导致治疗失效；此外，血制品来源的FVIII还存在潜在的病毒等病原体感染风险。因此，开发能够实现FVIII长期稳定表达、一次性治疗即可潜在“治愈”疾病的疗法，成为该领域迫切的临床需求。

基因治疗为攻克这一难题带来了曙光。其核心思路是通过载体将功能正常的FVIII基因导入患者体内特定细胞，使其能够自主生产FVIII，从而摆脱对反复输注的依赖。在众多策略中，靶向血小板表达FVIII展现出了独特优势。因为血小板在出血部位被激活时会释放其α颗粒内容物，若FVIII能在血小板内合成并储存，则可在出血局部释放高浓度的FVIII，更高效地启动凝血过程，可能对伴有抑制物的患者也有效。慢病毒载体（Lentiviral Vector, LV）因其能感染非分裂细胞并实现目的基因的长期稳定整合表达，成为体内基因治疗的有力工具。而骨髓作为造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HSPCs）的“家园”，通过直接骨髓内（Intraosseous, IO）注射递送LV，有望高效转导HSPCs，从而产生持续表达治疗蛋白的血细胞谱系。

基于此，由Cameron W. Rementer、Chong Li、Carol H. Miao等研究人员组成的研究团队，在成功治疗HemA小鼠模型的基础上，为进一步推动该创新疗法向临床应用迈进，选用了与人类凝血系统更为接近的大型动物模型——HemA犬，开展了一项关键的临床前研究。他们的研究成果发表在《Blood Vessels, Thrombosis》期刊上，证实了IO递送血小板特异性FVIII-LV基因疗法在大型动物中的安全性、有效性和持久性。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）构建血小板特异性慢病毒载体：使用VSVG假型化的LV，携带由血小板特异性糖蛋白Ibα（Gp1bα）启动子驱动的犬F8基因（G-cF8-LV）；2）大型动物模型与基因治疗：以4只天然发生的HemA犬为研究对象，通过IO注射将G-cF8-LV直接导入其胫骨或髂骨骨髓；3）长期多指标安全性有效性评估：在长达数月的实验期内，定期监测动物健康状况、血液生化指标、载体拷贝数、血小板FVIII表达水平、整体凝血功能（如血栓弹力图Thromboelastography, TEG）以及年出血事件发生率的变化。

所有狗从手术中恢复良好，血液化学值在正常范围内

IO注射手术后，所有接受治疗的HemA犬均顺利恢复，未出现与手术或基因治疗直接相关的严重不良事件。定期监测的血液生化指标均维持在正常参考范围内，初步表明该治疗程序具有良好的耐受性。

可在血小板中检测到犬FVIII，最高表达在术后40-50天左右，并且在所有治疗犬的整个实验期间表达持续存在

通过特异性检测方法，研究人员在所有经基因治疗的犬的血小板裂解物中均成功检测到了犬FVIII抗原。其表达动力学显示，FVIII水平在治疗后逐渐上升，在约40-50天达到峰值，之后虽略有波动，但在整个实验观察期内（超过100天）持续存在，证明了该疗法能够实现FVIII在血小板内的长期、稳定表达。

从外周血单核细胞基因组DNA中持续检测到转基因的拷贝数

为了评估载体在体内的持久性，研究人员从外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中提取基因组DNA进行定量PCR分析。结果持续检测到整合的转基因拷贝，这与血小板中FVIII的持续性表达相吻合，证实了LV成功转导了造血祖细胞，并实现了转基因在血细胞系中的稳定遗传和长期存在。

全血凝固时间缩短和血栓弹力图测试评估的多个时间点的参数改善表明基因治疗后止血功能得到改善

功能性评估是检验疗效的关键。研究人员发现，治疗后犬的全血凝固时间显著缩短。更重要的是，通过TEG这种能够全面评估凝血动态过程的技术进行分析，发现多个参数（如反应时间R时间、凝血形成时间K时间等）在治疗后的多个时间点均得到改善，表明整体的凝血功能，包括凝血启动速度和凝块强度，都较治疗前有明显提升。这直接证明了血小板表达的FVIII具有生物学活性，并能有效改善HemA犬的止血能力。

此外，IO基因治疗耐受性良好，在治疗犬中未产生任何毒性

全面的安全性评估显示，整个研究过程中，实验犬未出现与基因治疗相关的毒性反应，如异常炎症反应、器官功能损伤或肿瘤生成迹象。载体整合位点分析也未发现明显的克隆优势生长，进一步支持了该疗法的安全性。

最重要的是，与之前相比，接受基因治疗的狗每年出血事件减少

最具临床意义的指标是年出血事件的发生率。与基因治疗前相比，所有接受治疗的HemA犬在治疗后观察期间内的自发性或轻微创伤后出血事件显著减少。这一结果直接将实验室的分子、细胞和功能指标改善与最终的临床获益联系起来，强有力地证明了该疗法的潜在治疗价值。

结论与意义

本研究成功地在大动物HemA模型中验证了IO递送血小板特异性FVIII-LV基因疗法的可行性。该策略实现了FVIII在血小板内的靶向、长期表达，显著改善了模型的凝血功能，并有效降低了出血频率，且在整个研究过程中表现出良好的安全性和耐受性。这项研究是将该创新性基因治疗策略从小鼠模型推向临床应用的关键一步，为后续的人体临床试验提供了重要的临床前数据支持和概念验证。它展示了一种潜在的安全、有效且可能适用于部分产生FVIII抑制物患者的体内基因治疗新途径，为血友病A的根治性治疗带来了新的希望。