在模拟干旱条件下，与 japonicum 根瘤菌和荧光假单胞菌共接种的绿豆（Vigna radiata L.）的共生固氮作用及养分吸收

《Cogent Food & Agriculture》：Symbiotic N2 fixation and nutrient uptake of mung bean (Vigna radiata L.) co-inoculated with Bradyrhizobium japonicum and Pseudomonas fluorescens under simulated drought conditions

绿豆在干旱胁迫下接种根瘤菌与假单胞菌的共生效应研究。采用随机完全区组设计，测定不同水分胁迫下共接种Bradyrhizobium japonicum和Pseudomonas fluorescens对绿豆生长、固氮及营养积累的影响。结果显示，共接种处理使氮固定量达71%，显著提升株高、生物量及Fe、Zn等微量元素吸收，且在50%水分胁迫下表现最佳。

　　这项研究聚焦于利用植物促生根际细菌（PGPR）来提升绿豆（*Vigna radiata* L.）在干旱胁迫下的生长能力。通过将*Bradyrhizobium japonicum*和*Pseudomonas fluorescens*单独或联合接种于绿豆植株，研究探讨了这两种细菌联合使用对绿豆生长、营养成分和固氮能力的影响。实验采用随机完全区组设计，在温室条件下进行，每个处理设置四个重复。研究结果表明，同时接种这两种细菌显著提升了固氮量，达到了29.51至56.23 kg·ha?1。此外，研究还发现绿豆的地上部生物量、籽粒产量以及宏量和微量营养元素的吸收能力均有显著提升。这些发现表明，通过接种相容的根际细菌可以增强绿豆在干旱环境下的抗逆性，从而改善其整体表现。

### 1. 引言

在农业生态系统中，豆科植物与微生物之间的共生关系是其生长和营养吸收的关键因素。这类微生物，尤其是根瘤菌，能够通过固氮酶将大气中的氮气转化为植物可利用的氮源。豆科植物与根瘤菌的共生关系使得氮和碳的交换成为维持这一关系的核心。植物为细菌提供可利用的碳水化合物，而细菌则利用这些碳水化合物作为能量来源，并启动氮气固氮过程。然而，高温、土壤贫瘠、酸性以及干旱等环境因素会限制豆科植物的固氮能力，并降低生物固氮（BNF）的效率。

近年来，植物促生根际细菌因其在农业中的潜在应用而受到越来越多的关注。与传统化学肥料相比，PGPR可以减少对农业生态系统的负面影响，并且在成本方面更具优势。研究表明，PGPR在各种生物和非生物胁迫条件下都能改善作物的生长表现。一些研究指出，接种含有ACC-脱氨酶的PGPR与根瘤菌可以增强豆科植物的生长、结瘤和产量。不同种类的PGPR，如*Enterobacter*、*Klebsiella*、*Pseudomonas*、*Azospirillum*、*Azotobacter*、*Arthrobacter*、*Bacillus*和*Serratia*，均被证实为有益的土壤微生物，能够促进植物生长。

其中，*Pseudomonas fluorescens*是一种常见的农业土壤细菌，因其多种特性成为PGPR的理想候选者。研究显示，*Pseudomonas fluorescens*与*Rhizobium meliloti*的联合接种可以显著提升鹰嘴豆的产量和生长表现。此外，PGPR如*Pseudomonas oryzihabitans*与*Bradyrhizobium* sp.的联合应用也被发现能够改善共生关系、营养积累和大豆的产量。虽然PGPR与根瘤菌的联合接种被认为是缓解干旱对固氮和豆科植物生长影响的有效手段，但*Pseudomonas fluorescens*与*Bradyrhizobium japonicum*的联合接种在绿豆中的应用尚未被深入研究。已有研究表明，*Pseudomonas fluorescens*与*Rhizobium meliloti*的联合接种可以显著促进苜蓿的结瘤过程，这表明PGPR与根瘤菌的联合接种对豆科植物的结瘤具有积极作用。此外，Zahir等人的研究也验证了PGPR与根瘤菌联合接种对豆科植物生长和固氮能力的提升潜力。

微生物机制在提高植物对宏量和微量营养元素的吸收能力方面也起着至关重要的作用。例如，根瘤菌、固氮菌和念珠蓝菌可以促进氮的固氮；*Bacillus*、根瘤菌和*Enterobacter*能够溶解磷，提高其可利用性；*Clilopilus hobsonii*和*Aspergillus aculeatus*则有助于钾的溶解；根瘤菌和*Pseudomonas*能够产生铁载体，从而提高铁的可溶性；*Pseudomonas*和*Bacillus*有助于锌的迁移；*Asperterreus*和*Acinetobacter*则对锰的溶解具有重要作用。微生物还通过生物化学机制，如有机酸、酶和铁载体的释放，来改变矿物化合物的化学键，使它们更容易被植物吸收。这些机制在维持植物的生长和产量方面发挥着重要作用。

### 2. 材料与方法

#### 2.1 实验地点

实验在南非弗洛里达科学校园的温室中进行，使用18厘米的塑料花盆。实验地点的气候属于湿热亚热带气候，夏季温暖且多雨，冬季温和或寒冷。白天平均温度为26.4°C，夜间平均温度为23.4°C，平均相对湿度为70%。实验于2021年9月至11月进行。土壤由南非Builders South Africa公司提供的*Culterra*表层土壤（15 dm3）和蛭石袋组成。在种植前，土壤与蛭石按40%与60%的比例混合，并且两者都经过灭菌处理。实验中选择了“Berken”这一绿豆品种，因为它在南非广泛种植并容易获得。Berken颜色为绿色，是南非农民常用的品种。种子由南非Johannesburg的Heirloom Seeds公司提供。接种物（*Pseudomonas fluorescens*和*Bradyrhizobium japonicum*）由南非Durban的MBFi (Pty) Ltd公司提供。

#### 2.2 实验设计

实验采用6×3（处理×水分条件）的完全随机设计，每个处理设置六个重复。处理包括单独接种*Bradyrhizobium japonicum*（BR）、*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*联合接种（BRP）、单独接种*Pseudomonas fluorescens*（P）、*Pseudomonas fluorescens*与硝酸盐联合接种（PN）、单独使用硝酸盐（N）以及未接种的对照组（C）。植物被分为三个组，分别代表不同的干旱胁迫水平：正常水分控制组（100%盆容量）、中度胁迫组（50%盆容量）和重度胁迫组（25%盆容量）。盆容量是指花盆能容纳的水量。为了确定水分条件，将1升水倒入18厘米的花盆，让其自然排水1小时，剩余水量为400毫升，被定义为100%盆容量。200毫升为50%盆容量，50毫升为25%盆容量。

#### 2.3 土壤化学性质测定

在种植前，采集土壤样本，晾干并过筛（2 mm）。从中取样分析磷（Bray & Kurtz, 1945）、钙、铜、铁、钾、镁、锰、钠和锌的含量，采用乙酸铵法进行测定。

#### 2.4 种植

种子在种植前被手工挑选，以避免畸形种子的存在。种子通过多次浸泡在3.5%的商用次氯酸钠溶液和70%的乙醇中进行表面灭菌。在实验开始前，种子用双蒸水彻底冲洗三次，以去除化学残留。种子在蒸馏水中浸泡24小时以打破休眠状态。每个处理使用四个重复花盆。幼苗通过1 mL处于指数生长期的菌液（10?–10?个细胞/mL）进行接种，使用无菌微量移液器。0.5克硝酸钾溶解在5 mL的MacCartney瓶中，每盆使用1 mL进行接种。硝酸钾由Minema（www.labcon.co.za）提供。在幼苗完全出土后，进行间苗，每盆保留一株植物。

#### 2.5 植株高度和叶片数的测定

研究考察了*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*联合接种对绿豆叶片和高度的影响。通过手动计数统计每株植物的叶片数，使用30厘米的尺子在种植后27天、50天和87天分别测量植株高度。

#### 2.6 植株采样与处理

在开花至早期荚果填充阶段，进行植株采样以测定干物质产量和1?N同位素分析。将植株分为地上部、根部和根瘤三部分，统计每株植物的根瘤数量。地上部在60°C下烘干至恒重（48小时）以测定干物质产量，并研磨成细粉末（0.85 mm筛）用于1?N/1?N同位素分析。

#### 2.7 氮固定量的测定

#### 2.7.1 1?N/1?N同位素比值

绿豆的地上部样本在60°C下烘干（48小时），研磨后称重（2–3 mg）并放入铝锡胶囊中，随后在质谱仪上测定1?N/1?N比值，使用CarloErba NA1500元素分析仪连接至Finnigan MAT252质谱仪。1?N的自然丰度以delta符号表示，即样本的1?N自然丰度与大气氮气（0.36637 atom % 1?N）之间的偏差。delta1?N（‰）计算公式为：delta1?N = (样本1?N/1?N比值 - 大气1?N/1?N比值) × 100。

#### 2.7.2 地上部氮含量

植物样本的氮含量由地上部氮百分比和地上部干重计算得出。公式为：地上部氮含量（g·株?1） = 地上部氮百分比 × 地上部干重。

#### 2.7.3 氮素来源百分比（%Ndfa）

氮素来源百分比（%Ndfa）通过以下公式计算：%Ndfa = (参考植物delta1?N - 植株delta1?N) / (参考植物delta1?N - 大气delta1?N) × 100。其中，参考植物delta1?N是参考植物的1?N自然丰度，而植株delta1?N是豆科植物的1?N自然丰度，B值代表完全依赖大气氮气固氮的测试豆科植物的1?N自然丰度。B值取代了大气氮的值，因为它考虑了与氮气固定的同位素分馏效应。在本研究中，B值（?2‰）来自Raji等人（2019）的预设值。

#### 2.7.4 固定氮量

固定氮量根据Maskey等人（2001）和Shearer与Kohl（1986）的方法计算，公式为：固定氮量（kg·ha?1） = %Ndfa × 豆科植物生物量氮含量。

#### 2.7.5 土壤氮吸收量

土壤氮吸收量根据Unkovich与Baldock（2008）的方法计算，公式为：土壤氮吸收量 = 总豆科植物生物量氮含量 - 固定氮量。

#### 2.7.6 绿豆叶片营养元素含量测定

1克绿豆地上部样品在瓷坩埚中于500°C下燃烧整夜（12小时）以测定矿物质元素（P、K、Ca、Mg、Na、Fe、Cu、Zn、Mn和B）。灰分溶解于5 mL的6 M HCl中，并在50°C下烘烤30分钟。随后加入35 mL的去离子水。使用Whatman No. 1滤纸过滤混合物。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定植物提取物中矿物质元素的浓度，基于三个重复样品。

#### 2.7.7 统计分析

使用GenStat 12版进行统计分析。通过双因素方差分析（ANOVA）比较接种物活动和水分胁迫水平的均值。显著差异也被观察到。多重范围检验用于区分均值并测试其在p ≤ 0.05时是否显著不同。

### 3. 结果

#### 3.1 土壤分析

在种植前采集的土壤样本的化学性质被测定。土壤中含有的钙为9.52 mg·kg?1，铜为9.90 mg·kg?1，铁为675.90 mg·kg?1，钾为573 mg·kg?1，镁为4.37 mg·kg?1，锰为471 mg·kg?1，钠为29 mg·kg?1，锌为214 mg·kg?1。

#### 3.2 参考植物的δ1?N

四种类别的非豆科参考植物（*Lactuca sativa*、*Spinacia oleracea* L.、*Brassica oleracea var. capitate*和*Solanaceae*）被纳入并分析，以计算绿豆的%Ndfa。参考植物的δ1?N值范围为+2.12‰至+2.55‰，平均值为+2.34‰。

#### 3.3 地上部生物量

绿豆的地上部生物量在接种物（p ≤ 0.01）和干旱胁迫水平（p ≤ 0.05）下表现出显著差异。然而，接种物与干旱胁迫水平之间的交互作用未显著影响地上部生物量（p ≥ 0.05）。在中度胁迫（50% PC）下，地上部生物量显著高于其他两个水平，达到1.56 g·株?1。在重度胁迫下，地上部生物量最低，为1.01 g·株?1。*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著提高了绿豆的地上部生物量（2.0 g·株?1），并提升了地上部氮浓度、氮含量、%Ndfa和土壤氮吸收量，相较于未接种的对照组（0.85 g·株?1）。

#### 3.4 氮含量与氮浓度

干旱胁迫和接种物类型对绿豆氮含量和氮浓度的影响显著。在中度胁迫（50% PC）下，绿豆的氮浓度保持一致（0.01%）。*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著提升了绿豆的氮含量（3.17 mg），而其他接种物则保持在0.01%。未接种的对照组的氮含量最低（1.01 mg）。

#### 3.5 地上部δ1?N与%Ndfa值

*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著降低了绿豆的地上部δ1?N值（0.15‰），并提升了%Ndfa值（71.08%）。而未接种的对照组的%Ndfa值为51%。在本研究中，中度胁迫（50% PC）下的土壤氮吸收量最高，而重度胁迫下的土壤氮吸收量最低。有趣的是，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种使绿豆的土壤氮吸收量达到最高值（67.67 kg·ha?1）。

#### 3.6 绿豆的营养元素积累

*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著提升了绿豆的地上部生物量（2.35 g·株?1）和根部生物量（0.48 g·株?1）。此外，这种联合接种还提高了绿豆的叶片数（14.00 ± 0.29）和植株高度（14.98 ± 0.28 cm，19.52 ± 0.39 cm，20.98 ± 0.51 cm）。而单独接种*Pseudomonas*和硝酸盐的组合显著提升了绿豆的地上部生物量（1.75 g·株?1）和叶片数（10.00 ± 0.57和11.00 ± 0.68），并提升了植株高度（13.47 ± 0.41 cm，16.22 ± 0.31 cm，17.33 ± 0.51 cm）。这些结果与之前的研究一致，表明*Bradyrhizobium*和*Azospirillum*的组合可以改善大豆的生长表现。

#### 3.7 绿豆的营养元素积累

绿豆的营养元素积累受到接种物类型和不同干旱胁迫水平的影响。在一项关于豆类和鹰嘴豆的研究中，*Rhizobium sp*与PGPR的联合接种提高了结瘤、植物生长和营养吸收。在本研究中，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种提高了钙和铁的积累。单独使用硝酸盐、*Pseudomonas fluorescens*或*Bradyrhizobium japonicum*也能改善所有接种物和水分胁迫水平下的矿物质积累。在本研究中，当水分被完全灌溉时，绿豆的氮、磷、钾和镁的吸收量显著减少。干旱胁迫也对植物营养元素如氮、磷、钾、钙和镁的吸收产生负面影响。酸性细菌如*Acinetobacter*和真菌如*Aspergillus terreus*释放Mn2?离子，使锰对植物可利用，这一相互作用提高了大豆和水稻的光合效率和抗逆性。

#### 3.8 绿豆的氮素来源百分比

*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著提升了绿豆的氮素来源百分比（71%），而未接种的对照组仅为51%。这表明，联合接种显著提高了绿豆对大气氮的依赖程度。在本研究中，绿豆在中度胁迫（50% PC）下吸收了最多的氮，而重度胁迫下的吸收量最低。同时，*Pseudomonas*与硝酸盐的联合接种也显著提升了绿豆的氮吸收量（59.41 kg·ha?1）。绿豆的土壤氮吸收量在中度胁迫下最高，而在重度胁迫下最低。然而，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种使绿豆的土壤氮吸收量达到最高值（67.67 kg·ha?1）。

### 4. 讨论

许多研究表明，干旱会抑制植物生长、结瘤和固氮能力。例如，在2011/2012年，巴西的豆类产量下降了11.8%，而在2015/16年，美国也出现了严重的作物损失。在本研究中，中度（50% PC）至重度（25% PC）胁迫下的绿豆的%Ndfa值为55%–56%，而正常水分条件下的%Ndfa值为57%。*Bradyrhizobium japonicum*与*Azospirillum brasilense*的联合接种通过群体感应机制提升了豆类的共生表现。在本研究中，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种使绿豆的%Ndfa值达到71%，远高于未接种的对照组（51%）。绿豆作为具有固氮能力的豆科植物，其固氮量通常在6至112 kg·ha?1之间。在本研究中，重度胁迫下的绿豆固氮量为41.09 kg·ha?1，低于正常水分条件（43.93 kg·ha?1）和中度胁迫（56.04 kg·ha?1）下的固氮量。这可能是因为当植物长期缺乏水分时，固氮能力受到脱水土壤的显著限制。此外，*Pseudomonas*与硝酸盐的联合接种也使绿豆的氮吸收量显著增加。

绿豆的营养元素积累受到接种物类型和不同干旱胁迫水平的显著影响。在一项关于豆类和鹰嘴豆的研究中，*Rhizobium sp*与PGPR的联合接种提升了结瘤、植物生长和营养吸收。在本研究中，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种提高了绿豆在正常水分条件下的钙和铁的积累。单独使用硝酸盐、*Pseudomonas fluorescens*或*Bradyrhizobium japonicum*也能改善所有接种物和水分胁迫水平下的矿物质积累。这些结果与Jain和Saraf（2023）的研究一致，他们发现使用*Bacillus sonoresis*、*Pseudomonas stutzeri*或*Paenibacillus polymyxa*能提升簇豆的钠、镁、钙和磷的积累。在干旱胁迫下，氮、磷、钾和镁的吸收量在生长后期比生长初期更高。干旱胁迫也对植物营养元素如氮、磷、钾、钙和镁的吸收产生不利影响。酸性细菌（*Acinetobacter*）和真菌（*Aspergillus terreus*）释放Mn2?离子，使锰对植物可利用，这种相互作用提高了大豆和水稻的光合效率和抗逆性。

### 5. 结论

本研究成功评估了*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*联合接种对绿豆在模拟干旱条件下的生长相关参数、共生固氮和营养积累的影响。绿豆通过固氮获得了71%的氮源，其固氮量也得到了显著提升。*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种显著提升了绿豆的结瘤、生长和产量相关参数。相比之下，单独使用硝酸盐、*Bradyrhizobium japonicum*或*Pseudomonas fluorescens*也能提升营养积累。本研究建议将PGPR作为生物肥料使用，以缓解干旱的影响并提高豆科植物的产量和性能。因此，*Bradyrhizobium japonicum*和*Pseudomonas fluorescens*可作为补充生物肥料，在干旱频发地区种植绿豆，因为绿豆对干旱胁迫较为敏感。本研究表明，*Bradyrhizobium japonicum*与*Pseudomonas fluorescens*的联合接种不仅显著提升了绿豆的固氮能力和生长表现，还提升了绿豆在干旱条件下的宏量和微量营养元素的浓度。此外，本研究还提供了一种潜在的生物肥料策略，用于在干旱地区实现绿豆的可持续生产。因此，我们建议在不同环境中进行田间试验，以进一步验证上述潜力，因为本实验仅在温室条件下进行。