人类真菌病原体组织胞浆菌中分泌性胱氨酸结蛋白扩张揭示毒力因子

《Cell Reports》：Expansion of secreted cystine knot proteins reveals virulence factors in the human fungal pathogen Histoplasma

本研究针对人类真菌病原体组织胞浆菌(Histoplasma)效应因子鉴定难题，研究人员通过生物信息学分析开展毒力因子发现研究，成功鉴定出25个knottin蛋白的显著扩张。功能研究表明KNOT1-4在巨噬细胞内生存和宿主细胞裂解中起关键作用，其中KNOT2和KNOT4对小鼠体内毒力至关重要。该研究不仅揭示了knottin蛋白在真菌致病中的新机制，还开发了KNOTTIN_FINDER和KNOTTIN_TOPOLOGY_SCAN算法，为其他病原体效应因子发现提供了通用工具。

　　

在微生物致病机制研究领域，真菌病原体如何操纵宿主细胞环境一直是个未解之谜。特别是人类真菌病原体组织胞浆菌(Histoplasma)，它能在哺乳动物体内引起组织胞浆菌病，但其致病机制却远不如细菌病原体研究得深入。这种 thermally dimorphic（热双型）真菌在土壤中以多细胞菌丝和孢子形式存在，一旦被吸入哺乳动物肺部，体温就能诱导其转变为出芽酵母形态，成为致病形态。

组织胞浆菌最令人困惑的能力是它能被肺泡巨噬细胞吞噬却不被杀死，反而能逃避免疫系统清除并最终诱导宿主细胞死亡。虽然已知少数毒力因子如Cbp1在这一过程中发挥作用，但大多数效应因子仍然未知。研究人员从植物真菌病原体研究中获得灵感，意识到许多效应因子都是小分子分泌蛋白，富含半胱氨酸，能在病原体形态中高表达。

为了系统解决这一难题，Rodriguez等人在《Cell Reports》上发表了他们的最新研究。他们采用多学科交叉方法，结合生物信息学分析、蛋白质结构预测和功能实验验证，揭示了组织胞浆菌中一类特殊蛋白家族——knottin蛋白的惊人扩张及其在致病过程中的关键作用。

研究采用的主要技术方法包括：基于基因组序列的KNOTTIN_FINDER算法开发，基于AlphaFold2蛋白质结构预测的KNOTTIN_TOPOLOGY_SCAN算法，利用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除株，小鼠感染模型（C57BL/6J品系），巨噬细胞感染实验以及亚细胞分级分离技术。

Bioinformatic analysis identifies putative Histoplasma virulence factors

研究人员首先建立了鉴定组织胞浆菌效应因子的生物信息学标准：小分子（≤250氨基酸）、分泌性（Phobius预测）、富含半胱氨酸（≥4个半胱氨酸）以及在酵母形态中表达。通过对组织胞浆菌转录组数据的分析，他们从9,580个转录本中鉴定出226个符合前三个标准的候选蛋白，进一步筛选获得15个推定的效应因子，其中包括三个已知的毒力因子Cbp1、Sod3和Yps3。

Knottins are greatly expanded in Histoplasma species and not in other closely related fungi

令人惊讶的是，候选效应因子中包含三个knottin蛋白。Knottin结构域也称为抑制剂胱氨酸结(ICK)蛋白，以其独特的结状结构而闻名。研究人员开发了KNOTTIN_FINDER算法，基于knottin基因结构特征（所有半胱氨酸密码子位于单个外显子内）在组织胞浆菌基因组中鉴定出25个推定的knottin蛋白，远超过先前已知的12个。系统发育分析显示，这种knottin扩张现象在组织胞浆菌及其近缘种Emergomyces中特别显著，而在其他真菌中很少见。

Knot1-4 are required for Histoplasma virulence in macrophages

研究人员选择四个代表性knottin（KNOT1-4）进行功能研究。通过CRISPR-Cas9构建敲除株发现，KNOT1、KNOT3和KNOT4对巨噬细胞内真菌生长至关重要，而KNOT2虽然不影响细胞内生长，却是宿主细胞裂解所必需的。乳酸脱氢酶(LDH)实验证实所有四个knottin都对巨噬细胞裂解有贡献。

Knot1-4 access the host cytosol but are not required for ISR activation

亚细胞分级实验表明，Knot1-4蛋白在感染过程中都能进入宿主细胞质，这与已知毒力因子Cbp1的行为类似。然而，与Cbp1不同，这些knottin蛋白并不负责激活整合应激反应(ISR)，因为敲除任一knottin都不会影响ISR标志物TRIB3的表达水平。

KNOT2 and KNOT4 are required for Histoplasma virulence in vivo

小鼠感染实验显示，knot2Δ和knot4Δ突变株的毒力显著减弱。虽然感染突变株的小鼠出现轻微体重下降，但最终都能恢复，而野生型感染则导致死亡。真菌负荷实验表明，knot2Δ突变株在肺和脾中的负荷适度降低，而knot4Δ突变株从感染早期就开始表现出更显著的负荷降低。

研究结论表明，组织胞浆菌经历了knottin蛋白家族的显著扩张，这些蛋白在真菌致病过程中发挥关键作用。尽管基因组中存在约25个knottin基因，但单个knottin的缺失就足以影响病原体的毒力，说明它们各自具有不可替代的功能。研究人员开发的计算生物学工具不仅能有效识别组织胞浆菌中的毒力因子，还具有广泛应用于其他病原体效应因子发现的潜力。

这项研究的局限性在于依赖于现有数据集，且由于组织胞浆菌遗传操作的困难性，未能对所有25个knottin进行完整的功能表征。未来的研究需要进一步阐明knottin蛋白的具体作用机制及其在宿主-病原体相互作用中的分子靶标。

该工作通过多学科方法成功揭示了knottin蛋白在人类真菌病原体致病过程中的重要作用，为理解真菌致病机制提供了新视角，同时开发的生物信息学工具将为病原体效应因子研究领域带来重要推动。