藻源amphidinols：替代亚硫酸盐抑制酒香酵母Brettanomyces bruxellensis的新型生物防治策略

《LWT》：Algal amphidinols, an alternative to sulfites in the fight against Brettanomyces bruxellensis

本研究针对葡萄酒酿造中Brettanomyces bruxellensis污染导致的挥发性酚类物质（4EP/4EG）超标问题，通过提取海洋微藻Amphidinium carterae中的amphidinols（AMs），系统评估其在不同酿酒条件下的杀菌效果。结果表明，AM18在18.2-36.4 mg·L-1浓度下可完全抑制酒香酵母生长并阻断挥发性酚合成，且对SO2耐药菌株有效，为替代亚硫酸盐提供了新方案。

　　

在葡萄酒酿造的世界里，一场看不见的微生物战争始终在进行。其中，酒香酵母Brettanomyces bruxellensis（简称Brett）堪称酿酒师的"头号公敌"。这种酵母在红葡萄酒中肆意生长时，会产生4-乙基苯酚（4EP）和4-乙基愈创木酚（4EG）等挥发性酚类物质，给葡萄酒带来令人不悦的"马厩味"、"皮革味"等异常香气，严重影响品质。更棘手的是，Brett还能产生乙酸，导致葡萄酒酸度超标，甚至引发"鼠臭味"缺陷。据统计，因此类缺陷导致的葡萄酒降级或报废，每年给全球葡萄酒行业造成巨大经济损失。

长期以来，二氧化硫（SO₂）一直是控制Brett生长的标准武器。但如今，这一传统方法正面临前所未有的挑战。全球气候变暖导致葡萄酒pH值普遍升高，而SO₂的抗菌效果高度依赖低pH环境，这使得其活性形式比例大幅下降。更糟糕的是，近年来出现的三倍体Brett菌株（如AWRI1499-like遗传群）对SO₂表现出显著耐药性，即使高浓度添加也难以完全抑制其生长。

面对这一困境，酿酒界积极探索替代方案。壳聚糖（chitosan）虽被广泛应用，但其效果受葡萄酒基质、菌株差异和壳聚糖组成影响较大，稳定性不足。二甲基二碳酸酯（DMDC）等化学方法则存在使用限制和安全性争议。而过滤、闪蒸巴氏杀菌、超声波等物理方法不仅成本高昂，还可能改变葡萄酒的基质特性。正是在这一背景下，法国勃艮第大学的研究团队将目光投向了海洋微藻中的天然活性物质——amphidinols（AMs）。

amphidinols是一类从海洋甲藻Amphidinium属中分离的聚酮类化合物，具有广泛的生物活性。此前研究表明，多种AMs对 Aspergillus niger（黑曲霉）、Candida albicans（白色念珠菌）等病原真菌表现出显著抑制作用，其作用机制与两性霉素B类似，通过与细胞膜上的甾醇（如麦角甾醇）结合，形成跨膜孔道，导致细胞内容物泄漏而死亡。然而，这类化合物在酿酒微生物控制领域的应用潜力尚未被充分挖掘。

发表于《LWT》的这项研究，首次系统评估了Amphidinium carterae藻提取物（ICC001）在真实酿酒条件下对Brett的抑制效果。研究人员通过150天的长期监测，结合流式细胞术、平板计数和SPME/GC-MS分析，全面揭示了AMs对Brett生长和代谢的调控作用。同时，通过HPLC跟踪AM18在葡萄酒基质中的降解动力学，并利用分级纯化技术验证了AMs在杀菌活性中的核心作用。

关键技术方法概述

研究采用两株具有代表性的Brett菌株：三倍体LO417（SO₂耐药型）和二倍体LO2E2。通过梯度适应法将酵母逐步驯化至葡萄酒环境。藻提取物ICC001（主要含AM18、AM19、AM22）以9.1-36.4 mg·L^-1 AM18当量浓度进行处理，并与0.6 mg·L^-1分子SO₂、100 mg·L^-1壳聚糖进行对比。采用流式细胞术（cFDA染色）和平板计数法同步监测细胞活性，SPME/GC-MS检测挥发性酚类，HPLC分析AM18降解动力学。

3.1. 藻提取物对酒香酵母发育的影响

在模拟葡萄酒陈酿条件下（pH 3.8、酒精体积分数13.5%、18°C、限氧），ICC001表现出剂量依赖性的杀菌效果。当AM18浓度达到18.2 mg·L^-1时，无论初始接菌量（10³或10⁴ CFU·mL^-1）或菌株类型（二倍体/三倍体），Brett均在24小时内完全失活，且150天内无复苏现象。值得注意的是，对SO₂耐药的LO417菌株同样被有效抑制，而相同条件下的SO₂处理组在15-30天后即出现菌体再生。流式细胞术与平板计数结果高度一致，表明AMs不会诱导Brett进入可存活非可培养状态（VBNC），这一特性优于亚硫酸盐的处理效果。

3.2. 对挥发性酚类合成的抑制

经150天培养后，对照组葡萄酒中4EP+4EG总量超过2500 μg·L^-1，远超感官阈值（约400 μg·L^-1）。而AM18≥18.2 mg·L^-1的处理组均未检测到挥发性酚类积累，效果与100 mg·L^-1壳聚糖相当。值得注意的是，低浓度AM18（9.1 mg·L^-1）处理组在菌体再生后仍能合成挥发性酚类，进一步证实抑菌效果与代谢抑制的关联性。

3.3. 最小抑菌浓度确定

在酿酒条件下，AM18对Brett的MIC值为：初始污染量10³ CFU·mL^-1时为9.1 mg·L^-1，10⁴ CFU·mL^-1时为18.2 mg·L^-1。这一浓度范围显著低于壳聚糖的使用剂量（100 mg·L^-1），且不受菌株遗传背景影响。

3.4. amphidinols的作用验证

通过藻提取物分级实验发现，仅含AMs的F2组分（AM18占比80%）具有与全提取物相当的杀菌活性，而不含AMs的F1组分（蛋白质/盐类）无抑菌效果。富含色素及其他聚酮类的F3组分显示部分抑菌活性，但效果弱于F2。该结果明确证实AMs是藻提取物杀菌活性的主要贡献者。

3.5. AM18的降解动力学

HPLC监测显示，AM18在葡萄酒中随时间逐渐降解，降解速率与初始浓度相关。18.2 mg·L^-1处理组10天后即检测不到AM18，而72.8 mg·L^-1组可持续30天。值得注意的是，即使AM18完全降解后，Brett生长仍被持续抑制，表明其作用为杀菌性而非抑菌性。对比有无酵母存在的葡萄酒基质，AM18降解曲线无显著差异，排除其通过吸附于菌体表面而消耗的可能性。

结论与展望

本研究首次证实amphidinols在真实酿酒环境中对Brett bruxellensis具有高效、持久的杀菌作用。其独特优势体现在三个方面：首先，作用机制基于膜甾醇相互作用，对SO₂耐药菌株同样有效；其次，降解产物无残留风险，且不会诱导VBNC状态；第三，所需剂量远低于传统防腐剂。这些特性使AMs成为替代亚硫酸盐的理想候选者。

未来研究需进一步评估AMs对酿酒酵母（S. cerevisiae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（H. uvarum）等有益微生物的影响，探索在甜葡萄酒强化、起泡酒稳定化等场景的应用潜力。同时，需明确AMs与葡萄酒成分的相互作用机制，及其对酒体感官品质的影响。随着藻类培养技术的进步和提取工艺的优化，amphidinols有望为葡萄酒微生物控制开启绿色、精准的新篇章。