乳酸乳球菌天然质粒功能解析：代谢与工业性状的协同调控机制

《Journal of Dairy Science》：Dissecting native plasmids functions in Lactococcus lactis: synergistic regulation of metabolism and industrially relevant traits

本研究针对非模式菌株乳酸乳球菌C20中3个天然质粒的功能不明确问题，通过组合敲除策略系统解析了其进化起源及协同调控机制。研究发现pLL2对菌株生长和代谢具有关键作用，质粒间存在功能互补，同时揭示了质粒对乳酸对映体纯度和乳酸链球菌素合成的显著影响，为理性设计工业菌株提供了重要理论基础。

　　

在微生物的世界里，小小的质粒却扮演着大角色。作为染色体外的遗传元件，天然质粒如同细菌的"瑞士军刀"，携带各种功能基因帮助宿主适应复杂环境。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为重要的工业发酵菌株，广泛应用于食品、医药等领域，其天然质粒的研究一直备受关注。然而，当前研究多集中于模式菌株，对非模式菌株中质粒的功能认知仍存在大量空白。

特别是在工业应用背景下，研究人员发现不同乳酸乳球菌菌株携带的质粒数量和大小差异显著，从2kb到258kb不等，这种多样性暗示着质粒可能对菌株的工业性状产生重要影响。但是，质粒如何影响宿主代谢、它们之间是否存在协同作用、以及如何利用这些认识进行菌株改良等问题，都有待深入探索。正是这些未知，促使天津大学化工技术团队对乳酸乳球菌C20菌株中的3个天然质粒展开了系统研究。

研究人员选择《Journal of Dairy Science》发表了他们的研究成果，通过创新的实验设计回答了上述问题。他们采用的主要技术方法包括：基于CRISPR-Cas9的质粒组合消除技术，通过设计单sgRNA、双sgRNA和三sgRNA表达盒，实现不同质粒组合的特异性敲除；利用生物信息学工具对质粒基因功能进行系统分析；通过发酵动力学监测菌株生长和代谢变化；采用HPLC技术精确测定代谢产物浓度和乳酸对映体纯度。

原生质粒在乳酸乳球菌中的携带情况

研究人员首先对公开数据库和文献中报道的乳酸乳球菌菌株进行系统分析，发现不同菌株携带的质粒数量和总大小存在显著差异。有些菌株仅携带1个小型质粒，而有些菌株则拥有多达7个质粒，总大小超过200kb。这种多样性反映了乳酸乳球菌通过质粒获得的环境适应策略，也为理解质粒功能多样性提供了背景。

乳酸乳球菌C20中天然质粒的进化和功能分析

对C20菌株中3个质粒的深入分析显示，pLL1（82个基因）富含IS家族蛋白和原噬菌体序列，可能起源于噬菌体，含有D-乳酸脱氢酶基因等代谢相关基因。pLL2（41个基因）编码完整的I型限制修饰系统和AbiEi系统，具有防御外源DNA入侵的功能。pLL3（23个基因）主要编码转运蛋白，包括ABC转运蛋白和MFS转运蛋白，可能与营养摄取和代谢适应相关。

工程化乳酸乳球菌在不同天然质粒组合消除下的生长差异

通过组合消除策略构建的8个工程菌株表现出不同的生长特性。特别值得注意的是，pLL2的缺失导致菌株生长严重受损，表明该质粒对维持正常生长至关重要。而pLL3的缺失反而促进菌株生长，可能是由于减轻了代谢负担。三重质粒消除菌株（Δp123）的生长和产酸能力均显著下降，证实了天然质粒对菌株基本生理功能的重要性。

工程化乳酸乳球菌在产品水平上的进一步差异

在代谢产物分析中，研究人员发现不同质粒消除组合对乳酸产量和乳酸链球菌素（nisin）合成产生显著影响。pLL2缺失菌株的乳酸产量大幅降低，与生长受损一致。有趣的是，pLL3单独缺失的菌株表现出最高的乳酸产量和nisin效价，说明该质粒的消除可能释放了代谢资源。质粒组合消除实验还揭示了质粒间在代谢调控中的协同作用。

工程化乳酸乳球菌中L/D-乳酸对映体纯度的显著变化

通过手性HPLC分析，研究人员发现天然质粒对乳酸对映体的比例具有重要调控作用。pLL1携带D-乳酸脱氢酶基因，但其缺失后菌株仍能合成D-乳酸，表明可能存在其他补偿机制。三重质粒消除菌株在发酵后期主要产生L-乳酸，而pLL2缺失严重影响乳酸合成总量。这些发现说明天然质粒共同调控着乳酸对映体的平衡。

该研究通过系统解析乳酸乳球菌C20中3个天然质粒的功能，揭示了它们在菌株生长、代谢和工业性状形成中的协同作用。特别重要的是，研究发现pLL2对维持菌株正常生长具有不可替代的作用，而pLL3的消除反而能提高工业性能，这一发现为工业菌株的理性设计提供了新思路。质粒间的功能互补现象也提示我们在进行基因工程时需要考虑遗传元件的整体性影响。

这项研究的创新之处在于采用了组合消除策略，而非传统的单一质粒研究思路，从而能够揭示质粒间的相互作用。研究结果不仅深化了对乳酸乳球菌生物学特性的理解，更重要的是为利用合成生物学策略优化工业菌株性能提供了理论依据。通过精准调控质粒组合，未来可能开发出具有特定代谢特征的下一代乳酸乳球菌工程菌株，满足不同工业应用的需求。

研究还展示了天然质粒资源在微生物工程中的巨大潜力。相比引入外源基因，利用内源质粒进行菌株改良可能具有更好的遗传稳定性和环境适应性。这一策略特别适合食品工业中使用的菌株改造，因为涉及食品安全性的考量更为严格。

总之，这项研究为理解微生物天然质粒的功能网络提供了新视角，为工业微生物的理性设计开辟了新途径。随着合成生物学和基因编辑技术的不断发展，基于天然质粒功能解析的菌株优化策略有望在食品、医药和生物技术领域发挥越来越重要的作用。