核基因编码的线粒体RNA聚合酶人工突变恢复番茄细胞质雄性不育系花粉育性

《Plant Biotechnology Journal》：Artificial Mutations in the Nuclear Gene Encoding Mitochondrial RNA Polymerase Restore Pollen Fertility in Cytoplasmic Male Sterile Tomato

本研究发现线粒体RNA聚合酶（SlRPOTm）功能缺失可通过降低CMS相关基因orf137表达，恢复番茄细胞质雄性不育（CMS）系花粉育性。通过EMS诱变和CRISPR-Cas9基因编辑技术验证了SlRPOTm作为新型育性恢复（Rf）靶点的有效性，为利用CMS/Rf系统促进番茄F1杂交育种提供了新策略。

　　

1 引言

细胞质雄性不育（CMS）与核基因编码的育性恢复（Rf）蛋白之间的互作是植物杂种优势利用的关键机制。番茄作为全球广泛种植的蔬菜作物，其F₁杂交种生产长期面临去雄劳动力成本高和种子纯度保持困难的问题。虽然通过不对称体细胞杂交技术获得了携带orf137线粒体基因的番茄CMS材料，但现有野生种中发现的Rf基因恢复效果较弱，限制了CMS/Rf系统在番茄育种中的应用。

近年来，诱变育种为创制新型Rf材料提供了新思路。拟南芥CMS研究中，通过乙烷甲基磺酸（EMS）诱变获得了PPR蛋白功能缺失型恢复突变体；玉米CMS-S系统中，核糖体蛋白基因RPL6/RPL14的失活同样可恢复育性。这些案例表明，针对配子体CMS类型（其育性由花粉基因型决定），通过诱导功能缺失突变可能获得有效的Rf材料。

2 结果

2.1 EMS诱变创制番茄Rf新材料

以番茄CMS品系Dwarf ‘CMS[P]’为材料，分别用0.5%和1%EMS溶液处理种子，从M₁代群体中筛选出13个能通过自交结实的抑制突变体。通过连续回交获得BC₂F₁群体后，花粉萌发率检测显示各突变体育性恢复程度存在差异，其中EMS#1萌发率最高（39%），且大部分突变体的花粉异常形态（三孔爆裂）比例显著下降。

2.2 Solyc05g010660突变与育性恢复关联

对EMS#1群体进行混池分组测序（BSA）分析，在5号染色体2-8 Mb区域锁定Solyc05g010660和Solyc05g009410两个候选基因。全基因组测序证实Solyc05g010660在四个独立突变体（EMS#1/7/9/11）中均存在突变：EMS#1为内含子6的G→A突变；EMS#7第657位氨基酸产生终止密码子；EMS#9内含子11剪接位点突变；EMS#11第608位甘氨酸变为丝氨酸。BC₂F₂群体分离分析显示所有个体均携带突变，符合配子体CMS的遗传特征。

亚细胞定位实验表明Solyc05g010660编码的蛋白与拟南芥AtRPOTm同源，其sfGFP融合蛋白定位于线粒体，因此将该基因命名为SlRPOTm（Solanum lycopersicum RNA Polymerase of Mitochondria）。

2.3 SlRPOTm功能缺失验证

利用CRISPR-Cas9系统敲除SlRPOTm，获得三个独立突变株系（CR#4/8/9）。其中CR#4和CR#9分别产生4 bp缺失，CR#8出现227 bp大片段缺失，均导致移码突变。花粉萌发实验表明，突变体在柱头上的花粉管伸长与可育对照‘Micro-Tom’相当，而Dwarf ‘CMS[P]’完全不萌发，证明SlRPOTm功能缺失足以恢复CMS系花粉育性。

2.4 rpoTm突变对生殖发育的影响

在EMS#7/9/11的BC₂F₂群体中未获得纯合突变体，与拟南芥rpoTm突变导致胚胎致死的表型一致。而EMS#1群体中纯合个体占比14%，测序分析发现其内含子突变产生新的剪接位点，部分转录本保留8 bp内含子序列，形成SlRPOTm部分功能敲降而非完全敲除，这解释了其纯合个体可存活的原因。

纯合EMS#1植株营养生长减缓，鲜重显著降低，开花时间延迟2-3天，但花药宽度、花粉数量与野生型无差异。纯合突变体花粉萌发率提升至78%，异常花粉比例显著下降，表明rpoTm突变在恢复育性的同时未对雄性器官发育产生负面影响。

2.5 orf137表达下调与育性恢复的关联

通过环化RT-PCR（CR-RT-PCR）确定orf137转录起始位点上游4 bp处存在YRTA模体（CGTA），提示SlRPOTm可能直接启动其转录。RT-qPCR显示纯合EMS#1花药和花粉中orf137表达量显著降低。RNA-Seq分析进一步发现，突变体花药中线粒体基因组映射率下降，包括orf137、rps4、nad9等在内的多个基因表达下调，表明SlRPOTm功能缺陷导致线粒体转录组整体抑制。

2.6 rpoTm突变在F₁杂交育种中的应用

以EMS#1为父本与CMS系杂交，F₁代种子产量与正常杂交组合相当。构建的F₁（CMS-Rf）群体果实的坐果率达100%，果实大小和重量与正常F₁无显著差异，但单果种子数略有减少。值得注意的是，未携带Rf基因的F₁（CMS-M）产生单性结实，形成无籽果实，而Rf基因的引入恢复了有籽结实能力。

3 讨论

本研究首次证实线粒体RNA聚合酶功能缺失可作为一种新型育性恢复机制。相较于传统Rf基因（多为PPR蛋白功能获得型突变），SlRPOTm的失活突变可通过基因组编辑技术快速导入不同番茄品种，突破种质资源限制。针对配子体CMS类型，EMS诱变M₁代即可筛选表型，这与花粉基因型直接决定育性的特性密切相关。

SlRPOTm完全缺失导致胚胎致死，而EMS#1内含子突变产生的部分功能保留突变体，在保持育性恢复能力的同时减轻了对植株生长的抑制，为实际育种应用提供了理想靶点。研究结果揭示了线粒体转录调控与花粉发育的精细平衡，为解析CMS/Rf系统提供了新视角。

4 实验方法

实验材料为通过回交转育的矮化CMS品系Dwarf ‘CMS[P]’。EMS诱变采用0.5%-1%浓度处理浸种16小时。花粉萌发检测使用含15.1% PEG6000的液体培养基，柱头花粉管观察采用苯胺蓝染色法。基因编辑载体选用pDe-Cas9系统，通过农杆菌介导法转化番茄子叶。线粒体转录组分析采用RNA-Seq技术，测序数据映射至CMS[P]线粒体基因组（DDBJ登录号LC613119-LC613123）。亚细胞定位通过农杆菌瞬时表达sfGFP融合蛋白，配合MitoTracker Red线粒体染料共定位验证。