基于CRISPR-Cas9通路优化与P450过表达的耶氏解脂酵母微生物合成中长链α, ω-二醇的代谢工程研究

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica for enhanced microbial production of medium-chain α, ω-diols from alkanes via CRISPR-Cas9 mediated pathway optimization and P450 alkane monooxygenase overexpression

本综述系统阐述了利用代谢工程策略改造产油酵母耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica），实现从中链烷烃高效生物合成α, ω-二醇的创新研究。通过CRISPR-Cas9技术精准敲除脂肪酸氧化通路关键基因（如FADH、ADH1-8、FAO1、FALDH1-4），并结合过表达烷烃单加氧酶（P450 ALK1），成功将1,12-十二烷二醇产量提升29倍。该研究为从廉价烷烃原料可持续生产高价值聚酯前体提供了突破性技术路径。

　　

引言：中长链α, ω-二醇是合成聚酯和聚氨酯的关键前体，然而利用廉价烷烃原料进行微生物合成的研究尚不充分。产油酵母耶氏解脂酵母因其固有的疏水性底物代谢能力，在大肠杆菌等细菌系统之外为烷烃转化提供了独特优势。

材料与方法：为实现烷烃从头合成α, ω-二醇，研究采用CRISPR-Cas9技术敲除了10个参与脂肪醇氧化的基因（包括FADH、ADH1-8和FAO1）以及4个与脂肪醛氧化相关的基因（FALDH1-4），构建了氧化活性降低的工程菌株YALI17。通过过表达烷烃羟化酶基因（特别是ALK1）进一步强化代谢能力，并以正十二烷为底物在控制pH条件下评估发酵性能。

结果：工程菌YALI17从50 mM正十二烷中生产0.72 mM 1,12-十二烷二醇，较原始菌株提高14倍。在YALI17中过表达ALK1进一步将产量提升至1.45 mM，而自动化pH控制生物转化更达到3.2 mM。

讨论：本研究首次在酵母中成功实现了从中长链烷烃直接生物转化α, ω-二醇。理性通路设计和氧化途径阻断表明耶氏解脂酵母可作为烷烃生物制造的潜力细胞工厂，为通过靶向代谢工程可持续生产高价值二醇前体奠定基础。

基线烷烃代谢分析：通过对对照菌株YALI1的代谢表征发现，其倾向于将正十二烷过度氧化为1,12-十二烷二酸（0.76 mM），而目标产物二醇积累量极低（0.05 mM）。二醇与二酸的比例（0.06:1）证实了天然氧化途径的高效性，但大量底物未转化（2.8 mM）表明存在代谢瓶颈。

序列基因敲除策略：通过CRISPR-Cas9技术系统性靶向三个关键代谢节点：β-氧化（MFE1敲除）、脂肪醛氧化（FALDH1-4敲除）和脂肪醇氧化（FAO1、ADH1-9敲除）。时间进程分析显示，YALI17菌株在60小时培养后二醇产量达到0.72 mM，较基础菌株YAL2（0.52 mM）提升38%，证明途径阻断的累积效应。

代谢通路工程强化：在YALI17背景中过表达ALK1使二醇产量显著提升至1.45 mM，而ALK4和ALK7过表达分别达到0.83 mM和0.61 mM。值得注意的是，尽管二醇产量大幅提高，二酸副产物仍维持在10 mM以上，凸显终端氧化的代谢鲁棒性。

Alk基因抑制与过表达对比：采用dCas9-effector系统对ALK基因簇进行组合抑制（如ALK1/2、ALK4/5、ALK5/7、ALK11/12）反而导致二酸产量增加（1.7-2.0 mM），而二醇积累受限（0.03-0.12 mM），表明部分抑制会引发代谢重路由效应。

pH控制优化：在40 mL生物反应器中比较手动与自动pH控制（维持pH 7.5）的效果，发现自动化控制使二醇产量从1.4 mM提升至3.2 mM，证实碱性环境有利于P450单加氧酶的ω-羟基化活性。

结论：本研究成功构建了耶氏解脂酵母微生物平台，实现从烷烃直接合成中长链α, ω-二醇。通过多基因敲除和ALK1过表达的协同作用，将1,12-十二烷二醇产量提升29倍。尽管二酸副产物积累仍是挑战，该工作为烷烃价值化提供了关键技术基础，未来需通过蛋白工程、转运体改造和反应器优化进一步推进可持续生物制造。