Paf1C通过促进频率基因转录延伸调控粗糙脉孢菌生物钟的分子机制

《PLOS Genetics》：Paf1C regulates the Neurospora circadian clock by promoting the transcription elongation of frequency

本研究发现RNA聚合酶II相关因子1复合物（Paf1C）通过调控核心时钟基因频率（frq）的转录延伸过程，维持粗糙脉孢菌正常昼夜节律。研究揭示Paf1C亚基PAF-1和CTR-9通过促进RNAPII CTD Ser2磷酸化（Ser2p）和组蛋白H3K36三甲基化（H3K36me3），而RTF-1亚基通过介导RAD-6/BRE-1依赖的组蛋白H2B第131位赖氨酸单泛素化（H2BK131ub），协同保障生物钟运行的精确性。

　　

Abstract

生物钟使生物体能够适应外界环境变化，其核心振荡器的运行依赖于时钟基因的精确转录调控。虽然时钟基因转录起始的激活和抑制已被广泛研究，但转录延伸的调控机制尚不明确。本研究发现在粗糙脉孢菌中，RNA聚合酶II相关因子1复合物（Paf1C）对维持正常昼夜节律至关重要。缺失Paf1C的PAF-1、CTR-9或RTF-1亚基会导致昼夜节律周期缩短和相位提前。机制上，PAF-1和CTR-9亚基通过增强组蛋白H2B泛素化（H2BK131ub）、RNA聚合酶II CTD Ser2磷酸化以及H3K36三甲基化在frq开放阅读框区域的富集，促进时钟基因frq的转录。而RTF-1亚基通过与RAD-6/BRE-1泛素结合酶-连接酶复合物相互作用，调控全局H2BK131ub水平。引人注目的是，RTF-1中一个高度保守区域（HMD）几乎可以完全挽救rtf-1敲除菌株中的全局H2B泛素化缺陷和生物钟异常。这些结果表明，Paf1C通过促进组蛋白H2B泛素化和frq基因的转录延伸来调控粗糙脉孢菌的生物钟。

Introduction

昼夜节律在哺乳动物、植物、昆虫、真菌和蓝细菌中广泛存在。生物钟振荡器由正负元件组成，依赖于自动调节的转录/翻译反馈环路。在粗糙脉孢菌中，WC-1和WC-2形成异源二聚体复合物（WCC），节律性地结合frq基因启动子中的C-box以激活其转录。而FRQ与FRH形成FFC复合物，通过促进CKI/II介导的WCC磷酸化来抑制frq转录。FRQ合成后逐步被磷酸化并通过泛素-蛋白酶体途径降解，其周转导致WCC去抑制，重新启动frq转录。

表观遗传因子在基因转录调控中发挥作用，其中一些参与生物钟功能。在粗糙脉孢菌中，GCN-5、CHK1/2、IEC1-INO80复合物和SET-2等通过组蛋白修饰调控frq转录。在哺乳动物和拟南芥中，H2B泛素化也被证明对维持正常昼夜节律至关重要。

Paf1C由五个亚基组成，在真核生物中高度保守。研究表明，Paf1C通过促进RNA聚合酶II CTD Ser2磷酸化和特定组蛋白修饰来调控基因转录。虽然frq表达的转录激活和抑制已被广泛研究，但转录延伸因子在frq调控中的作用仍不清楚。

Results

The Paf1 complex is required for the normal period of N. crassa circadian rhythm

为确定Paf1C是否参与粗糙脉孢菌昼夜节律调控，研究人员通过同源重组构建了Paf1C各亚基的突变菌株。race tube实验表明，paf-1敲除和ctr-9敲除菌株生长缓慢，分生孢子稀疏，且昼夜节律周期比野生型缩短约3.5小时。rtf-1敲除菌株也表现出生长缓慢和节律周期缩短约1.5小时的特征。而cdc-73或leo-1敲除对生长速率和分生孢子节律影响不大。在光暗循环条件下，三种突变菌株的分生孢子节律相位比野生型提前2-3小时。

The Paf1C subunits play distinct roles in controlling the normal expression of the frq gene

进一步研究发现，paf-1敲除或ctr-9敲除突变体中FRQ蛋白水平和frq mRNA水平显著降低，而rtf-1敲除突变体中的表达水平与野生型相当。蛋白质稳定性实验表明，FRQ降解速率在突变体与野生型之间无显著差异，说明Paf1C主要通过促进frq转录而非影响FRQ降解来调控生物钟。

The Paf1C subunits directly bind to the frq locus for its regulation

染色质免疫共沉淀实验显示，PAF-1、CTR-9和RTF-1在frq基因ORF 3'区域的富集具有节律性，表明Paf1C直接结合frq基因位点进行调控。蛋白水平检测发现，paf-1敲除导致CTR-9蛋白水平下降，而rtf-1敲除不影响其他亚基蛋白水平。免疫共沉淀实验表明，RTF-1与其他四个Paf1C亚基的相互作用较弱，提示其可能以不同于PAF-1-CTR-9核心复合物的机制调控生物钟。

WCC-dependent frq transcription regulates the rhythmic association of PAF-1 and RTF-1 at the frq ORF

Paf1C作为RNA聚合酶II的通用转录延伸因子，其与frq ORF的结合依赖于WCC激活的frq转录。在wc-2敲除菌株中，PAF-1和RTF-1在frq ORF的富集显著降低。ChIP实验进一步显示，paf-1敲除和ctr-9敲除突变体中RNAPII CTD Ser2磷酸化、SET-2招募和H3K36me3水平在frq基因体区域显著降低，而rtf-1敲除突变体无此变化，表明PAF-1和CTR-9而非RTF-1在frq活跃转录阶段正调控转录延伸。

RAD-6 and BRE-1 function at the downstream of RTF-1 in controlling the circadian period of N. crassa

在酵母中，rtf1缺失导致Rad6-Bre1介导的全局H2B泛素化缺失。本研究构建了rad-6和bre-1敲除菌株，发现它们均表现出节律周期缩短。rad-6敲除菌株中FRQ蛋白和frq mRNA水平降低，而bre-1敲除菌株中的表达模式与野生型相似但光条件下表达升高。点突变实验证实H2B第131位赖氨酸是泛素化位点，且RTF-1和BRE-1通过H2BK131ub通路调控分生孢子节律。

Both HMD and Plus3 domains of RTF-1 play key roles in regulating the circadian rhythm

通过构建RTF-1不同功能域突变体，研究发现HMD结构域和Plus3结构域对维持正常昼夜节律至关重要。表达HMD结构域（24-221aa）或包含HMD的片段（3-221aa）足以挽救rtf-1敲除菌株的节律缺陷和H2B泛素化水平。免疫共沉淀证实RTF-1通过HMD与BRE-1相互作用，从而促进H2BK131ub。

The HMD domain of RTF-1 is both necessary and sufficient for the proper function of RTF-1 in regulating the circadian rhythm

进一步实验表明，RTF-1的HMD结构域对其在昼夜节律调控中的功能是必要且充分的。表达RTF-1 HMD片段可恢复rtf-1敲除菌株的节律周期和全局H2B泛素化水平，尽管其在frq位点的结合能力较弱，但仍能部分恢复H2BK131ub水平。

Discussion

本研究系统阐述了Paf1C通过调控frq基因转录延伸和H2B泛素化维持粗糙脉孢菌正常昼夜节律的分子机制。虽然Paf1C包含五个亚基，但各亚基功能存在差异：PAF-1和CTR-9主要促进转录延伸，而RTF-1主要通过RAD-6/BRE-1介导H2B泛素化。H2B泛素化缺失导致约1.5小时的节律周期缩短和2-3小时的相位提前，而PAF-1/CTR-9缺失引起的转录延伸缺陷导致更显著的节律异常。这些发现揭示了转录延伸过程在生物钟调控中的重要作用，并表明H2B泛素化调控昼夜节律在真核生物中是一种保守机制。