多步筛选平台开发靶向脾脏T细胞的脂质纳米颗粒用于体内基因编辑蛋白递送

《SCIENCE ADVANCES》：A multistep platform identifies spleen-tropic lipid nanoparticles for in vivo T cell–targeted delivery of gene-editing proteins

本研究针对基因编辑蛋白（特别是RNP）体内递送效率低、缺乏靶向性的难题，开发了一种多步筛选平台以优化脂质纳米颗粒（LNP）配方。研究人员通过体外高通量筛选和体内聚类筛选，成功鉴定出一种具有脾脏趋向性且优先靶向T细胞的LNP配方（F48），并利用该配方实现了脾脏T细胞中CCR5和PD-1的高效基因敲除，在HIV抵抗和癌症免疫治疗模型中展现出显著疗效。该研究为体内T细胞基因编辑提供了高效递送工具，并揭示了LNP设计的关键原则，推动了基因编辑疗法的发展。

　　

在生物医学研究的前沿，基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9系统，为治疗遗传性疾病、感染和癌症带来了革命性的希望。其中，直接递送预先组装好的Cas9蛋白和单链向导RNA复合物，即核糖核蛋白（RNP），相较于递送编码Cas9的信使RNA（mRNA）具有独特优势：它无需依赖细胞内的翻译机器，可以立即发挥编辑活性，同时避免了外源mRNA可能引发的免疫反应，并且由于其在细胞内存留时间较短，有助于减少脱靶效应。然而，将这些大分子、带电且易变性的基因编辑蛋白高效地送入目标细胞内部，尤其是体内的特定细胞类型，仍然是一个巨大的挑战。现有的递送方法，如病毒载体、电穿孔等，存在效率、毒性或可扩展性方面的局限。脂质纳米颗粒（LNP）作为成功递送mRNA新冠疫苗的明星载体，为蛋白质递送提供了新的可能，但其配方通常为核酸设计，尚未针对蛋白质的独特物理化学性质进行系统优化。

尤其具有挑战性但应用价值巨大的目标是体内T细胞工程化。T细胞在适应性免疫中扮演核心角色，是治疗传染病、自身免疫病和癌症的关键靶点。传统的离体方法（如CAR-T疗法）需要从患者体内分离T细胞，在体外进行基因改造、扩增后再回输体内，过程繁琐、昂贵且受个体差异限制。直接进行体内T细胞基因编辑则具有更好的可扩展性和应用前景，但实现高效、靶向的体内编辑困难重重。为了解决这些难题，研究人员在《科学·进展》（SCIENCE ADVANCES）上报道了他们的最新成果，他们开发了一个多步筛选平台，旨在优化LNP配方，用于基因编辑蛋白的高效递送，并重点关注了体内T细胞靶向这一难题。

为开展研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们构建了一个包含486种不同脂质配方的LNP库，系统性地改变了辅助脂质的类型和比例。其次，他们利用表达Ai9报告基因（tdTomato荧光蛋白激活依赖于Cre重组酶或特定RNP介导的基因编辑）的人胚胎肾细胞（HEK Ai9细胞）进行体外高通量筛选，以基因编辑效率（tdTomato阳性细胞百分比）作为评价指标。接着，他们采用了一种创新的体内聚类筛选策略，将体外筛选出的顶级配方分组（集群）后注射到Ai9报告基因小鼠体内进行初筛，再对表现优异的集群中的单个配方进行验证，从而高效地鉴定出体内有效的配方。此外，研究还利用机器学习模型分析筛选数据，揭示影响递送效率的关键配方参数。最后，在野生型C57BL/6小鼠和B16-OVA黑色素瘤模型中，通过流式细胞术、蛋白质印迹（Western Blot）和体内疗效评价，验证了优选LNP配方介导的功能性基因敲除效果。研究所用Ai9小鼠和C57BL/6小鼠均遵循相关动物伦理规定。

结果

体外筛选LNP介导的RNP递送

研究人员设计了一个包含486种独特LNP配方的库，这些配方系统性地改变了六种辅助脂质的组成。通过在高通量模式下在HEK Ai9细胞中测试这些LNP递送RNP的效率，他们发现不同配方的递送效率差异很大。含有阳离子辅助脂质DOTAP和DDAB的配方通常表现出更高的基因编辑效率，而两性离子辅助脂质如DOPE和DSPC则活性最低。机器学习分析进一步确认，较高的离子izable脂质和辅助脂质总含量、不饱和脂质尾部以及较低的脂质与蛋白质比例有助于提高基因编辑效率。

体内聚类筛选鉴定T细胞靶向基因编辑LNP配方

由于体内外环境的差异，研究人员采用了一种聚类筛选模式来高效评估体外优选配方在Ai9小鼠体内的表现。他们将顶级配方分成八个集群进行初步测试，发现DOTAP I和18PG I两个集群在脾脏T细胞中表现出最高的基因编辑活性，而在非淋巴器官中编辑活性极低。随后对优选集群中的单个配方进行验证，鉴定出配方F48为最佳候选，其在脾脏T细胞中实现了高达7.8%的基因编辑效率，且约69%的编辑事件发生在T细胞中，显示出对T细胞的高度特异性。体内成像也直观地证实了基因编辑事件主要发生在脾脏的CD3⁺ T细胞中。

C57BL/6小鼠中CCR5和PD-1的功能性基因编辑

为了评估平台的 therapeutic 潜力，研究人员使用F48 LNP递送靶向CCR5或PD-1的RNP。在C57BL/6小鼠中，两次注射F48-sgCCR5 RNP LNP后，在外周血和脾脏的T细胞（尤其是CD4⁺ T细胞）中观察到了CCR5蛋白表达的显著且持久的降低。类似地，在预先用卵清蛋白（OVA）mRNA免疫的小鼠中，单次注射F48-sgPD-1 RNP LNP即可导致脾脏T细胞（特别是CD8⁺ T细胞）PD-1表达大幅下降。在B16-OVA黑色素瘤模型中，与抗PD-1抗体治疗组相比，F48-sgPD-1 RNP LNP治疗显著抑制了肿瘤生长，并降低了肿瘤浸润CD8⁺ T细胞上的PD-1表达，证明了其在免疫检查点阻断（ICB）治疗中的 efficacy。

系统性筛选Cre重组酶的LNP配方

为了检验平台是否适用于不同性质的蛋白质，研究人员用相同的LNP库筛选了Cre重组酶的递送。结果显示，最优配方与RNP有所不同，更倾向于含有阴离子辅助脂质18PG和14PA的配方，这可能与Cre重组酶带正电的特性有关。体内筛选同样鉴定出有效的配方（如F53），但其编辑的免疫细胞类型分布更广，包括B细胞和树突状细胞（DC），这与RNP LNP主要靶向T细胞形成对比，表明 cargo 的特性会影响细胞嗜性。

顶级配方的体内分布揭示细胞类型依赖性胞内运输

对F48（RNP LNP）和F53（Cre LNP）的体内分布研究表明，尽管大部分LNP在肝脏积累，但基因编辑事件却主要发生在脾脏。流式细胞术分析显示，F48 LNP在脾脏中主要被T细胞摄取，而F53 LNP则更多地被B细胞和CD11c⁺ DC样细胞摄取。这强调了初始细胞摄取对于决定最终基因编辑效率的关键作用，也解释了为何肝脏积累高但编辑效率低——脾脏免疫细胞独特的胞内环境（如更酸性的内体pH）可能更有利于LNP的内体逃逸和蛋白质释放。

讨论与结论

本研究成功开发了一个系统的多步筛选平台，用于优化LNP介导的基因编辑蛋白体内递送。研究的关键发现在于鉴定出一种具有脾脏趋向性和T细胞靶向能力的LNP配方（F48），该配方能够高效地在体内递送RNP，实现脾脏T细胞的特异性基因编辑。这不仅克服了蛋白质递送的主要障碍，还实现了难以企及的体内T细胞靶向编辑。

研究的另一重要贡献在于通过机器学习分析，揭示了影响不同蛋白质 cargo（RNP 和 Cre）递送效率的LNP配方关键参数，为理性设计LNP提供了指导原则。例如，离子izable脂质和辅助脂质的总含量、脂质尾部不饱和度等都是重要因素，但其重要性因 cargo 而异，强调了配方优化的 cargo 特异性。

功能实验证实，该平台能够有效敲除T细胞中的关键治疗靶点CCR5和PD-1，并在肿瘤模型中展现出治疗潜力，为HIV抵抗和癌症免疫治疗提供了新的思路。值得注意的是，尽管LNP在体内主要分布于肝脏，但基因编辑却选择性地发生在脾脏T细胞，这揭示了细胞特异性胞内 trafficking 在决定编辑效率中的核心作用。

该研究的局限性包括聚类筛选策略可能存在漏选，以及 cargo 与配方之间的物理化学兼容性对细胞嗜性的影响有待进一步剖析。然而，这项工作无疑为基于蛋白质的体内基因编辑疗法，特别是针对免疫细胞的编辑，提供了强有力的工具和深入的设计见解，标志着向更精准、可及的基因医学迈出了重要一步。