西达本胺联合多柔比星通过清除衰老样细胞协同抑制TP53突变弥漫大B细胞淋巴瘤

《The FASEB Journal》：Chidamide Accelerates the Death of Senescence-Like Diffuse Large B-Cell Lymphoma Cells With TP53 Mutation Induced by Doxorubicin

本文系统研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）西达本胺（CHI）与化疗药物多柔比星（DOX）在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的协同抗肿瘤效应及机制。研究发现，CHI可降低突变p53（mutp53）蛋白水平，抑制DOX诱导的细胞衰老，并通过诱发不可修复的DNA损伤，促使衰老样DLBCL细胞发生程序性死亡。这种"One-two punch"（先诱导衰老再清除）策略为TP53突变DLBCL的治疗提供了新思路。

　　

1 引言

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种高度异质性的侵袭性恶性肿瘤，占成人非霍奇金淋巴瘤的30%–40%。尽管标准R-CHOP方案（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松）可治愈约三分之二的患者，但仍有三分之一患者出现复发或转移，其中TP53基因突变（包括突变和/或17p缺失）患者预后尤差，约占DLBCL患者的30%–50%。

多柔比星（DOX）作为R-CHOP方案中的关键细胞毒性药物，通过抑制拓扑异构酶II诱导DNA双链断裂发挥抗肿瘤作用。低剂量DOX在降低心脏毒性的同时，更容易诱导肿瘤细胞进入衰老状态，反而增加DLBCL复发风险。细胞衰老曾被认为是抗癌治疗中的有益反应，但越来越多证据表明，治疗诱导的衰老癌细胞可能重新获得增殖能力，导致肿瘤复发。因此，选择性清除治疗诱导的衰老肿瘤细胞——即senolytic疗法——成为减少肿瘤复发的新策略。

西达本胺（CHI）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），已获批用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤，但尚未获批用于DLBCL。研究表明，CHI可通过诱导凋亡发挥抗DLBCL作用，且与化疗药物联用可改善患者预后。特别值得注意的是，有病例报道显示CHI联合化疗能降低p53蛋白表达水平，使TP53突变DLBCL复发患者获得持续缓解。由此推测，CHI与具有诱导衰老作用的低剂量DOX联用，可能具有清除衰老细胞、协同抗DLBCL的效果。

2 材料与方法

研究采用三种DLBCL细胞系：RI-1、SU-DHL-8（均携带TP53突变）和OCI-LY3（p53野生型）。通过CCK8法检测细胞活力，流式细胞术分析细胞周期和凋亡，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老，彗星实验检测DNA损伤，Western blotting分析相关蛋白表达。此外，还建立了SU-DHL-细胞系移植的BALB/c裸鼠模型进行体内验证。

3 结果

3.1 CHI对DLBCL细胞的抑制作用

CHI以时间和浓度依赖性方式抑制DLBCL细胞活力，对RI-1、SU-DHL-8和OCI-LY3细胞的48小时IC₅₀值分别为1.75±0.20μM、0.26±0.04μM和0.98±0.12μM。CHI处理48小时后，DLBCL细胞S期比例减少，G1期阻滞，同时显著诱导RI-1和SU-DHL-8细胞凋亡，而OCI-LY3细胞主要表现为坏死。Western blotting结果显示，CHI浓度依赖性地上调caspase-3活化形式，表明其能诱导caspase-3介导的细胞凋亡。

3.2 CHI降低DLBCL细胞中突变p53蛋白水平

基础p53蛋白表达分析显示，p53野生型OCI-LY3细胞中的p53蛋白水平显著低于p53突变型RI-1和SU-DHL-8细胞。CHI处理24小时后，突变p53蛋白在RI-1和SU-DHL-8细胞中显著降低，而在野生型OCI-LY3细胞中略有升高。RT-qPCR检测发现，CHI处理后SU-DHL-8和RI-1细胞中TP53 mRNA水平显著降低，而OCI-LY3细胞中TP53 mRNA水平升高，表明CHI可特异性降低突变p53而非野生型p53蛋白水平。

3.3 CHI与DOX协同降低细胞活力

DOX单药对RI-1、SU-DHL-8和OCI-LY3细胞的48小时IC₅₀值分别为0.23±0.069μM、0.048±0.004μM和0.017±0.001μM。联合指数（CI）分析显示，CHI与DOX联用在p53突变的RI-1和SU-DHL-8细胞中CI值分别为0.32±0.185和0.30±0.06，表现出强协同效应；而在p53野生型OCI-LY3细胞中CI值为1.1±0.13，仅为相加效应。台盼蓝染色显示，联合用药组活细胞密度在所有时间点均低于单药组，且随时间推移持续下降。

3.4 CHI抑制DOX诱导的DLBCL细胞衰老

细胞周期分析显示，CHI诱导G1期阻滞，DOX诱导G2期阻滞。两药联用后，RI-1细胞G2期阻滞增强，SU-DHL-8细胞G1和G2期比例增加，S期比例减少。Western blotting显示，CHI下调Cyclin B蛋白，联合用药同时下调Cyclin B和Cyclin D蛋白，但不影响CDK2水平。

SA-β-gal染色显示，DOX处理48小时后，RI-1和SU-DHL-8细胞呈现明显衰老特征：细胞体积增大，SA-β-gal活性上调，蓝色染色显著。CHI单药未诱导明显衰老，而两药联用后蓝色染色消失，衰老标志蛋白p21、p16和IL-6水平降低，p53蛋白水平也显著下降。通过慢病毒转导敲低RI-1细胞中p53表达证实，p53参与DOX诱导的DLBCL细胞衰老。

3.5 CHI联合DOX促进DLBCL细胞凋亡

Annexin V染色显示，联合用药组凋亡率显著高于单药组。Western blotting表明，单药处理时凋亡标志蛋白水平无显著变化，而联合用药显著增加cleaved caspase-3蛋白水平，导致下游PARP1蛋白切割和细胞凋亡。caspase抑制剂Z-VAD-FMK可逆转CHI+DOX诱导的caspase-3活化。

联合用药下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2和Bcl-XL水平，上调促凋亡蛋白NOXA、PUMA和Bax水平。DNA损伤标志蛋白γ-H2AX在联合组显著上调。彗星实验显示，单药组无彗星拖尾现象，而联合治疗后出现明显拖尾，表明CHI联合DOX引起显著DNA损伤。

3.6 CHI联合DOX在体内表现协同抗肿瘤作用且毒性低

SU-DHL-8细胞移植的BALB/c裸鼠模型中，联合用药组脾脏体积最小，对淋巴瘤脾脏浸润的抑制效果最显著。流式细胞术检测脾脏中huCD45阳性细胞显示，联合组CD45阳性细胞较对照组显著减少。更重要的是，联合用药组小鼠体重在21天给药期间稳定增加，表明CHI与DOX联合治疗耐受性良好。

4 讨论

本研究证实，CHI与DOX在p53突变DLBCL细胞中表现出强协同抗肿瘤活性，而在p53野生型细胞中仅为相加效应。机制上，CHI通过降低mutp53蛋白水平，抑制DOX诱导的细胞衰老，同时阻碍p53介导的DNA损伤修复功能，导致不可修复的DNA损伤，最终使细胞绕过衰老状态直接进入凋亡程序。

这种"One-two punch"策略——先利用低剂量DOX诱导肿瘤细胞衰老，再使用CHI特异性清除衰老细胞——为TP53突变DLBCL提供了一种有前景的治疗选择。尤其值得注意的是，联合用药在体内表现出良好耐受性，为后续临床转化奠定了基础。然而，体内研究结果显示协同效应较体外更为温和，提示生物体复杂性可能影响治疗效果，未来研究需进一步优化治疗方案。