综述：自然杀伤细胞免疫衰老的表型、机制及治疗策略

《Immunity & Ageing》：Phenotypes, mechanisms, and therapeutic strategies of natural killer cell immunosenescence

本综述系统阐述了自然杀伤(NK)细胞在衰老过程中的表型演变、功能衰退机制及其与年龄相关疾病（如感染、动脉粥样硬化、恶性肿瘤）的临床关联。文章深入探讨了端粒缩短、代谢失调（如线粒体功能障碍、糖基化）、细胞因子信号紊乱（如IL-2、IL-15）以及转录因子（T-bet、Eomes）表达变化等关键分子事件，并前瞻性地提出了基于NK细胞的治疗策略（如自体NK细胞输注疗法），为干预免疫衰老提供了新的视角和潜在靶点。

　　

背景

自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的核心效应细胞，在对抗感染和肿瘤中发挥着不可或缺的作用。NK细胞约占循环淋巴细胞的5%-20%，根据CD56和CD16的表面表达差异，主要可分为CD56^brightCD16^-NK细胞和CD56^dimCD16⁺NK细胞两个主要亚群。CD56^dimCD16⁺NK细胞约占外周血NK细胞的90%，被认为是具有高细胞毒活性的成熟NK细胞(mNK细胞)。相反，数量较少的CD56^brightCD16^-亚群（约10%），即未成熟NK细胞(iNK细胞)，在IL-2、IL-12或IL-18刺激下能产生丰富的细胞因子和趋化因子。值得注意的是，CD56^brightCD16^-NK细胞具有分化为成熟CD56^dimCD16⁺NK细胞的能力。此外，在慢性人类免疫缺陷病毒(HIV)感染中还鉴定出另一个独特的NK细胞亚群，称为CD56^-CD16⁺NK细胞。

免疫衰老源于氧化应激、线粒体功能障碍、表观遗传修饰和持续性DNA损伤等多种损伤信号。其特征是免疫器官结构的破坏和重塑，以及先天性和适应性免疫的功能障碍，导致个体更容易受到感染、恶性肿瘤和自身免疫性疾病的影响。免疫衰老过程中会发生多种代谢变化，包括糖酵解改变、线粒体功能障碍和活性氧(ROS)产生增加。识别免疫衰老相关特征对于探索其影响和临床意义至关重要。

免疫衰老的NK细胞亚群

越来越多的证据表明，NK细胞亚群在免疫衰老过程中经历显著的表型改变和功能衰退。

CD56^dimCD16⁺NK细胞

目前的研究数据显示，老年人群中NK细胞的数量和比例大多保持稳定或增加，只有少数研究报告有所下降。这些差异可能源于研究人群的年龄范围、性别分布、种族背景、健康状况和评估NK细胞的方法不同。年龄依赖性NK细胞亚群变化揭示了一致的趋势：CD56^brightNK细胞减少，同时CD56^dim亚群扩增。表面标志物CD57已被确定为NK细胞衰老的标志物，与复制性衰老和增殖能力受损相关。横断面研究和纵向研究均证实，老年人中CD56^dimCD57⁺NK细胞的比例更高。与CD57^-NK细胞相比，CD57⁺NK细胞对细胞因子或靶细胞刺激的增殖能力降低。由于老年人中巨细胞病毒(CMV)感染率很高，因此很难区分衰老和CMV对NK细胞的具体影响。最近根据CMV血清学对供体进行分层的研究表明，CD56^dimNK细胞上CD57的上调与CMV血清阳性相关，而非单纯与衰老相关。这些研究还观察到多种NK细胞表面标志物的伴随下调，包括NKp30和CD161。此外，推测CD56^dimNK细胞中穿孔素的表达模式会随衰老而下降，从而直接影响NK细胞介导的对衰老细胞的裂解。

CD56^brightCD16^-NK细胞

CD56^brightCD16^-NK细胞随年龄增长呈现数量减少和进行性功能衰退，共同导致免疫调节能力恶化。老年人CD56^brightNK细胞水平下降可能与造血干细胞数量和功能的年龄相关变化，以及产生新NK细胞的能力减弱有关。研究发现，与年轻的CD56^brightNK细胞相比，衰老的CD56^brightNK细胞的细胞因子（如IFN-γ、MIP-1α、IL-8）产生水平显著降低。

CD56^-CD16⁺NK细胞

CD56^-CD16⁺NK细胞被认为是功能失调的细胞，其特征包括低复制、毒性降低、细胞因子分泌减少、抑制性NK受体表达增加以及自然细胞毒性受体(NCRs)和NKG2D表达降低。CD56^-CD16⁺NK细胞代表一个成熟群体，在老年人中扩增。与CD56^dimNK细胞相比，CD56^-CD16⁺NK细胞具有CD57^lowKIR^low表型，并伴有T-bet表达减少和端粒延长。

适应性NK细胞

适应性NK细胞由急性或慢性病毒感染（如CMV和HIV）诱导产生。这些特化细胞表现出显著的 longevity，在健康个体中可稳定存在6个月至4年。它们还表现出一定程度的抗原特异性免疫记忆。与常规NK(cNK)细胞不同，适应性NK细胞通常表现出升高的NKG2C表达。激活后，适应性NK细胞显示出增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，并产生更多的IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。此外，通过单细胞转录组测序，发现了一个在衰老过程中积累的记忆样促炎性CD52⁺NKG2C⁺CD94⁺NK亚群，其与2019冠状病毒病(COVID-19)的疾病严重程度相关。

小鼠NK细胞的免疫衰老

值得注意的是，老年小鼠模型中NK细胞亚群的变化与人类观察到的不同。几项研究表明，老年小鼠的成熟NK细胞（通常鉴定为CD11b^lowCD27^highKLRG1⁺亚群）数量和迁移能力下降，导致未成熟CD11b^-CD27⁺KLRG1^-NK细胞相对积累。然而，老年小鼠骨髓中成熟NK细胞的频率保持不变，这表明循环中成熟NK细胞的减少可能源于骨髓中成熟效率降低和成熟NK细胞流出受损。需要进一步研究以确定复杂因素（如CMV感染）是否解释了人和小鼠之间NK细胞变化的差异。

NK细胞免疫衰老的机制

NK细胞免疫衰老的遗传基础

端粒缩短

在调节NK细胞寿命的因素中，端粒长度起着关键作用。端粒依赖性衰老发生在淋巴细胞克隆性扩增和端粒丢失之后，这是由持续抗原刺激细胞分裂所致。端粒缩短由细胞分化促进，因此，成熟CD56^dimNK细胞比未成熟CD56^brightNK细胞具有更短的端粒。研究表明，NK细胞经历年龄依赖性的端粒磨损和端粒酶活性的进行性丧失。衰老NK细胞中观察到的端粒缩短可能源于干细胞端粒耗竭、免疫稳态或病毒感染诱导的增殖，或这些因素的组合。需要进一步研究以阐明潜在机制。

已证明IL-2和IL-15可以增强端粒酶活性并上调端粒酶逆转录酶(TERT) mRNA水平，进而防止NK细胞中的端粒丢失。然而，NK细胞中的端粒长度受到衰老微环境中IL-2和IL-15可用性减少的影响，因为这些细胞因子在NK细胞稳态和端粒维持中起关键作用。此外，端粒酶活性会因凋亡内切核酸酶G(EndoG)易位至细胞核而受到抑制。调节性T(Treg)细胞可调节EndoG核转位，导致端粒丢失和细胞衰老。端粒缩短激活DNA损伤反应(DDR)和p53依赖性凋亡通路，从而诱导程序性细胞死亡。完全的端粒丢失可能导致染色体末端融合或断裂，造成基因组不稳定性，最终导致细胞坏死或有丝分裂灾难。

蛋白质表达谱的变化

使用计算机映射技术，确定了与小鼠衰老NK细胞表型相关的潜在基因。其中许多是蛋白质编码基因，根据蛋白质功能进行分类，以筛选与NK细胞活性直接或间接相关的基因。这些蛋白质功能包括细胞增殖、细胞毒性、内吞作用、凋亡、DNA甲基化、染色质结合、转录调控和自噬。这些选定的基因需要进一步验证。该研究首次揭示了NK细胞衰老表型的遗传基础，并为进一步研究NK细胞衰老的机制提供了见解。

NK细胞免疫衰老的代谢基础

已证明细胞代谢对于免疫细胞表型的产生和实现最佳免疫功能至关重要。

线粒体功能障碍

NK细胞衰老的一个特征可能是细胞信号传导和线粒体功能受损。老年人中活化NK细胞的呼吸能力下降，ROS产生增加，这影响了NK细胞的功能。研究人员发现，与年轻NK细胞不同，高水平IL-2刺激既不会增加衰老NK细胞的线粒体质量，也不会增加线粒体膜电位。此外，在老年供体的NK细胞中，IL-2不会增加PPAR-γ共激活因子1-α(PGC-1α)的表达，而PGC-1α可以增强线粒体功能和代谢，并对抗多种衰老相关疾病。线粒体功能障碍显著损害细胞活力并削弱抗肿瘤活性。

糖基化

糖基化是分子衰老的一个决定性特征，具体表现为晚期糖基化终末产物(AGEs)的形成。两种高效的产生AGEs的二羰基化合物是乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MGO)，它们在血浆中的水平在衰老和年龄相关疾病中升高。体外研究表明，GO和MGO都会干扰NK细胞的功能。此外，肿瘤细胞的糖基化可以破坏NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒功能。因此，糖基化对NK细胞功能产生显著的负面影响。

Pls-GPCR21信号通路

缩醛磷脂(Pls)是一种特殊的磷脂，在老年人中会减少。NK细胞表面特异性表达G蛋白偶联受体21(GPCR21)，它可以识别并结合Pls。Pls-GPCR21信号级联激活信号转导和转录激活因子5(STAT5)，从而诱导穿孔素-1的表达。然而，当Pls水平随年龄下降时，Pls-GPCR21信号级联下调，导致穿孔素-1表达受限和NK细胞功能受损。因此，这种信号级联的年龄依赖性减少可能是导致NK细胞免疫衰老的因素之一。

NK细胞免疫衰老的分子基础

细胞因子

多种细胞因子对NK细胞的发育、分化和功能至关重要。IL-2是连接适应性免疫和NK细胞的关键细胞因子，用于增强细胞因子释放、促进增殖和提高杀伤能力。先前的研究报告了NK细胞中IL-2信号通路的年龄相关损伤。这表明在老年人中，IL-2很少促进NK细胞的发育，产生较低水平的IFN-γ和IFN-α，同时升高IL-1、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10的水平。IL-2已被用作免疫治疗剂以促进NK细胞的抗肿瘤活性，并目前用于治疗转移性肾细胞癌(MRCC)和黑色素瘤。其他细胞因子（如IL-12、IL-15、IL-18）在NK细胞免疫衰老中也发挥着重要作用。

转录因子T-bet和Eomes

转录因子T-bet（由Tbx21编码）是一种酪氨酸和丝氨酸磷酸化蛋白，表现出造血谱系限制性表达。Eomes是另一个对免疫细胞，特别是调节CD8⁺T细胞和NK细胞的细胞毒活性至关重要的转录因子。T-bet和Eomes的表达均受衰老影响，并与NK细胞细胞毒性受损相关。在老年小鼠中，骨髓中T-bet和Eomes的表达与NK细胞成熟不良呈负相关。研究发现，导致NK细胞成熟和功能损伤的一个因素是非造血环境。衰老的非造血环境可能通过下调转录因子Eomes和T-bet的水平来影响NK细胞的成熟和功能，这一点通过它们在年轻环境中水平恢复得到支持。这表明外部因素导致了衰老表型，其他研究也证明了这一点。

MicroRNA

MicroRNAs是短的（约22 nt）、内源性激活的非编码RNA，作为转录后调节因子负调控基因表达。每个microRNA可以调节多个mRNA，一个mRNA也可以被多个microRNA调节。NK细胞的microRNA表达谱随衰老而变化。例如，miR-181a-5p水平降低导致NK细胞发育缺陷和功能下降。这表明我们可以通过调整microRNA的表达水平来保存或重建老年人NK细胞的功能。

肿瘤微环境中的NK细胞

肿瘤微环境中NK细胞活力和功能受损

免疫抑制性肿瘤微环境(TME)通过多种机制损害NK细胞的活力和功能。调节性T细胞(Tregs)分泌TGF-β，抑制NK细胞增殖和IFN-γ产生。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)通过CD80/CD86信号进一步抑制NK细胞活性。此外，肿瘤衍生的PGE2和腺苷抑制IL-2、IL-12、IL-15和IL-18等关键细胞因子的产生，并下调NKG2D等激活受体，从而降低NK细胞毒性。

除了免疫抑制因子，TME中的代谢应激显著破坏NK细胞功能。营养剥夺、缺氧、酸性pH和代谢废物积累不仅影响肿瘤细胞，而且严重损害NK细胞活性。NK细胞依赖糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)进行能量代谢，任一途径的中断都会减少IFN-γ分泌和细胞毒潜力。在多发性骨髓瘤中，缺氧抑制穿孔素和颗粒酶B的表达，同时下调NKG2D等激活受体。总的来说，这些代谢紊乱导致NK细胞在抗肿瘤免疫中的功能受损。

肿瘤微环境中NK细胞的代谢重编程

代谢重编程是指细胞改变其代谢途径和能量利用以适应环境变化或功能需求的过程。这个概念最初在癌症生物学（例如Warburg效应）中描述，后来已扩展到免疫细胞，包括NK细胞，它们动态调节其代谢以调节效应器功能。NK细胞的代谢可塑性代表了它们适应TME和增强抗肿瘤活性的基本机制。

研究表明，TME通常抑制NK细胞中的葡萄糖代谢，损害糖酵解和OXPHOS，从而削弱细胞毒功能。然而，研究表明，表现出"Warburg样"代谢转变（同时保持代谢灵活性）的NK细胞不仅在代谢恶劣条件下维持活力，而且显著增强了肿瘤杀伤能力。缺氧触发APOBEC3G介导的RNA编辑以促进应激适应。此外，IRE1α-XBP1-MYC轴有助于NK细胞活化，SREBP调节柠檬酸-苹果酸穿梭系统以影响IFN-γ和颗粒酶B等效应分子的产生。这些发现不仅将代谢重编程确立为TME中NK细胞功能的关键决定因素，而且为通过代谢调节开发下一代基于NK细胞的免疫疗法提供了概念框架。

NK细胞免疫衰老的临床关联

大量临床研究证实，老年人NK细胞活性的生理性恶化是多种疾病的重要风险因素，尤其与感染性疾病、动脉粥样硬化和恶性肿瘤密切相关。此外，研究表明，NK细胞计数较低的老年人死亡率高于NK细胞计数较高的老年人。现有数据似乎证实了NK细胞表型和功能随疾病进展而变化的观点。

感染性疾病

老年人病毒感染后，NK细胞库高度 skewed，并且由于NK细胞分化效率低下或病毒特异性NK细胞克隆和扩增受阻，无法补充初始NK细胞，这两者都可能损害NK细胞功能。如上所述，CMV感染与老年人CD57⁺NK细胞频率增加相关。研究表明，CMV血清阳性年轻成人的CD57⁺NK细胞频率显著高于CMV阴性年轻成人，但与CMV阳性老年人相似。这突出了在分析老年人NK细胞免疫衰老和癌症监测时考虑CMV感染的重要性。CMV感染患者中发生KIR⁺NKG2C⁺NK细胞的异常克隆扩增，占NK细胞总数的50%以上。类似地，多项研究表明，NKG2C^brightNK细胞在HIV、汉坦病毒、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染期间扩增。COVID-19中NK细胞活化谱表明疾病严重程度与CD56^brightNK细胞武装相关。通过单细胞测序发现，CD52⁺NKG2C⁺CD94⁺NK细胞亚群的聚集与COVID-19的严重程度相关。

动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种由动脉壁反复损伤引起的疾病。老年人发生动脉粥样硬化和其他疾病的风险增加，这与NK细胞活性降低有关。研究表明，CMV诱导的NKG2C⁺NK细胞（适应性NK细胞）扩增与颈动脉粥样硬化斑块(CAP)的不稳定性相关。高风险患者与较低风险个体相比，表现出更高水平的NKG2C⁺NK细胞。然而，另一项研究发现相反的效果，即CMV血清阳性受试者中适应性NK细胞富集与冠状动脉斑块负荷减少相关。这种差异缺乏结论性解释。适应性NK细胞的保护性和致病性作用可能在动脉粥样硬化的不同阶段有所不同。另一种可能性是颈动脉和冠状动脉粥样硬化在生物学发展上存在差异。要理解这种结果差异，需要进一步研究。

恶性肿瘤

NK细胞可以在恶性肿瘤发生和发展过程中控制肿瘤细胞的生长。然而，肿瘤微环境诱导NK细胞功能改变，促进免疫逃逸，最终助长恶性生长和转移。研究揭示了肿瘤微环境中NK细胞生物学的显著改变。他们的研究表明，虽然肿瘤总体表现出NK细胞浸润减少，但CD56^brightNK细胞的比例增加。值得注意的是，肿瘤内CD103⁺NK细胞亚群表面共抑制分子（如T细胞免疫受体与Ig和ITIM结构域(TIGIT)和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含蛋白3(Tim-3)）的表达显著高于CD103^-NK细胞。最重要的是，与邻近健康组织的NK细胞相比，这些肿瘤内NK细胞通过显著减少的颗粒酶B(GZMB)产生表现出功能受损，表明其在肿瘤环境中的细胞毒能力受到实质性抑制。此外，肿瘤表现出细胞毒性细胞因子IL-15水平降低和IL-6水平升高，后者抑制STAT-5通路和NK细胞活性。与健康组织邻近的NK细胞相比，肿瘤驻留NK细胞产生更少的GZMB，表明潜在的细胞毒活性丧失。

在肺癌中，NKp30和NKG2D的下调导致NK细胞呈现抑制性表型，GZMB的减少损害其溶细胞功能。在乳腺肿瘤中，NK细胞激活受体的表达降低，而抑制性受体的表达增加，限制了NK细胞的抗肿瘤免疫。研究表明，子宫内膜癌肿瘤微环境对驻留NK细胞有显著影响，因为它可以降低其细胞毒能力并重塑其表型和功能，最终促进肿瘤进展。慢性髓系白血病(CML)是一种与衰老相关的疾病（约一半病例在65岁以上人群中诊断）。一些研究揭示，CML患者在疾病的所有阶段都经历NK细胞进行性功能恶化。CML患者骨髓中CD57表达水平更高，外周血NK细胞表面TIGIT表达增加。由于增殖减少与CD57高表达相关，骨髓中NK细胞增殖减少。急性髓系白血病(AML)患者的NK细胞也下调激活受体NKp30、NKp46和DNAM-1的表达。

值得注意的是，NK细胞衰老似乎不仅仅是一种免疫紊乱，而且可能构成一种通过进化保存下来的用于宿主生命周期调节的适应性机制。子宫自然杀伤(uNK)细胞在母胎界面大量存在。在妊娠早期，胎儿滋养细胞分泌的可溶性HLA-G与uNK细胞的CD158d结合，激活DNA损伤反应通路并促进衰老表型。这个过程产生各种衰老相关分泌表型(SASP)因子，促进血管生成和滋养细胞侵袭。这揭示了妊娠期间NK细胞衰老的潜在生理意义，尽管这一机制仍有待更多研究进一步验证。

自体NK细胞输注疗法： rejuvenating 免疫功能

通过在体外扩增并回输自体NK细胞，该疗法可以有效清除衰老细胞，改善免疫功能，并减轻全身炎症反应。一项涉及37名健康中年志愿者的随机对照试验发现，接受自体NK细胞输注的受试者表现出衰老和耗竭T细胞亚群（CD28^-和CD57⁺亚群）显著减少，同时免疫抑制标志物（如PD-1⁺和TIM-3⁺）表达降低。此外，关键促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-17）水平显著降低，表明NK细胞疗法减轻了年龄相关的"炎性衰老"。额外研究揭示，扩增的NK细胞选择性消除衰老CD4⁺T细胞，同时保留正常CD4⁺T细胞，这种特异性可能由改变的表面受体表达（例如NKG2C/KLRG1下调和NKG2A/TIM3上调）介导。在老年小鼠模型中，自体NK细胞与多巴胺释放肽（阿片肽）联合使用协同增强了衰老细胞的清除效率，优于单一疗法，同时改善了组织功能并延长了健康寿命。另一项涉及五名健康老年人的小规模试验表明，体外激活并回输的NK细胞降低了衰老标志物（p16、β-半乳糖苷酶）的水平，效果持续超过八个月，并显著降低了炎症标志物。这些发现突出了自体NK细胞疗法在减轻免疫衰老方面的潜力