母体肥胖通过H3K9me3介导的表观遗传重编程调控子代性成熟期肝脏性别二态性建立的机制研究

《Biology of Sex Differences》：Establishment of sex-specific liver transcriptomes and H3K9me3 profiles during sexual maturity: the impact of maternal obesity

本研究针对母体肥胖（MO）增加子代代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）风险的临床问题，通过建立小鼠模型系统探究了MO对子代肝脏转录组和H3K9me3异染色质标记的性别特异性影响。研究发现性成熟过程中H3K9me3介导的表观遗传重编程是肝脏性别二态性建立的关键机制，而MO可破坏这一过程且其影响不能被产后饮食干预完全逆转。该研究为理解发育源性代谢疾病的性别差异提供了重要表观遗传学证据。

　　

随着全球肥胖率的持续攀升，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，原名非酒精性脂肪性肝病）的患病率也呈现急剧上升趋势，影响着约25-30%的成年人群。这一沉默的流行病不仅直接威胁肝脏健康，更是2型糖尿病和心血管疾病的重要风险因素。特别值得关注的是，育龄妇女肥胖率的增加对胎儿健康产生了深远影响，母体肥胖（MO）与子代发生MASLD的风险显著升高密切相关。

肝脏作为人体的代谢中枢，在碳水化合物和脂质代谢、蛋白质合成、胆汁分泌、先天免疫和解毒过程中发挥着核心作用。性激素对肝脏代谢具有深刻影响，雌激素能增强胰岛素敏感性、减少新生脂肪生成并抑制炎症，从而在绝经前女性中发挥对抗MASLD的保护作用。雄激素同样对肝脏代谢产生强烈影响，睾丸激素水平的改变与MASLD的发生发展密切相关。因此，肝脏表现出对营养应激源的性别激素特异性反应。

近年来，研究表明母体环境可通过表观遗传修饰影响子代基因表达，这些修饰在出生后仍然存在，从而影响代谢疾病风险。组蛋白修饰作为染色质结构和基因表达的关键调控因子，受到饮食和激素信号等多种因素的影响。组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）作为异染色质的标志性修饰，在发育过程中通过沉默分化细胞类型非必需基因程序发挥着至关重要的作用。这一修饰存在于着丝粒和端粒重复序列以及转座子元件（TEs）中，通过沉默这些元件维持基因组稳定性。H3K9me3也与常染色质区域相关，通过结合基因启动子区域抑制基因表达。

尽管肝脏功能存在明显的性别二态性，但这些性别差异的机制基础仍未完全阐明。关键科学问题包括：（1）性别特异性转录程序是在胎儿发育期间建立还是在出生后出现；（2）异染色质的表观遗传重塑（特别是通过H3K9me3组蛋白修饰）是否有助于性成熟时肝脏转录组的性别特异性变化；（3）母体肥胖如何在不同发育阶段差异性地影响雄性和雌性子代的肝脏基因表达和表观遗传修饰。

为了解决这些知识空白，Yadav等人在《Biology of Sex Differences》上发表了最新研究成果，通过分析3周龄和8周龄雄性和雌性子代肝脏的性别特异性基因表达和H3K9me3 profiles，考察了母体肥胖对这些相同时间点的影响。研究揭示了一个令人惊讶的发现：在3周龄小鼠中，来自对照饮食喂养母鼠的雄性和雌性子代的肝脏转录组几乎完全相同。然而，母体肥胖显著改变了两种性别的肝脏转录组。在3至8周龄期间，基因表达和H3K9me3 profiles发生了实质性变化，影响了细胞粘附、细胞骨架组织和先天免疫反应通路。这项研究为理解母体肥胖如何塑造发育中肝脏表观基因组和转录组，并可能影响子代长期代谢健康提供了新的见解。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。动物模型建立方面，雌性母鼠在交配前、整个妊娠期和哺乳期分别饲喂西方风格饮食或对照饮食，子代在3周龄断奶后转为标准维持饲料饲养5周。组织学分析采用苏木精-伊红（H&E）和油红O染色评估肝脏脂肪变性程度。血清生物化学指标通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和临床化学分析仪检测。肝脏组织脂质分析采用薄层色谱和气相色谱法测定甘油三酯和胆固醇酯的脂肪酸组成。转录组分析通过Illumina NovaSeq 6000平台进行RNA测序（RNA-seq），使用STAR进行序列比对，edgeR进行差异表达分析。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）使用H3K9me3特异性抗体，通过MAGnifty系统进行，MACS2进行peak calling，ChIPseeker进行基因组注释。生物信息学分析采用主成分分析（PCA）、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路富集分析等统计方法。

研究结果

性成熟期肝脏转录组性别二态性的建立

研究发现，在3周龄时，对照饮食母鼠的雄性和雌性子代肝脏基因表达谱极为相似，仅81个基因存在差异表达（FDR < 0.05）。这些基因主要富集于胆固醇和脂肪酸生物合成通路，且在雄性中表达水平更高。值得注意的是，10个差异表达基因位于性染色体上，包括Y染色体编码的Uty、Ddx3y、Eif2s3y等和X染色体编码的Xist、Acsl4、Kdm5c等。雌激素受体α（Esr1，肝脏主要亚型）在此时两性间无显著差异。

然而，到8周龄性成熟时，情况发生显著变化。主成分分析显示，无论MO状态如何，雄性和雌性小鼠均形成独立的聚类，表明成年肝脏中已建立明确的性别特异性基因表达特征。对照子代中，1,815个基因存在差异性表达（FDR < 0.05），涉及免疫反应调节、解毒过程、脂质代谢、细胞粘附和激素信号传导等多种生物学过程。

母体肥胖对肝脏转录组的显著影响

暴露于母体肥胖导致子代肝脏基因表达发生广泛改变。在3周龄时，与对照子代相比，MO雄性和雌性子代分别出现724和2,304个差异表达基因（FDR < 0.05）。通路富集分析显示，蛋白质翻译/延伸通路（主要涉及核糖体基因Rpl、Rps）在MO雌性子代中下调最为显著。免疫相关基因簇，如“急性期反应信号”和“内源性配体对Toll样受体（TLR）的调节”（C3、Serpina1、Fga/b/d1等）在两性中大多下调。胆固醇生物合成通路多个基因（Sqle、Lss、Fdft1）在两性中均下降，而脂肪酸氧化（线粒体和过氧化物酶体）和酮生成基因（Hadha/b、Decr1、Eci2、Hmgcs2）显著上调。三酰甘油生物合成通路仅在雌性中显著富集。与脂滴形成相关的关键基因（Cidec、Fitm2）和脂肪酸转运蛋白CD36在两性中均显著上调。谷胱甘肽介导的解毒（Gsta2/3/4、Gstm1/2/3/4、Gstp1）和外源物代谢通路（Nqo1、Aldh1b1/3a2/7a1）在两性中一致性下调，在雄性中下降更为明显。

到8周龄时，MO与对照子代间的差异表达基因数量显著减少（雄性58个，雌性2个），且仅有13个基因与3周龄时的差异表达基因重叠，表明随着发育进程和饮食干预，基因表达变化趋于正常化。

H3K9me3在建立肝脏性别特异性功能中的作用

研究发现，在从早期产后发育到性成熟的过渡期间，H3K9me3 profiles发生了显著变化。与3周龄时间点相比，在8周龄时鉴定出大量差异性结合（DB）峰：雄性6,527个（与3周相比，8周时上调3,583个，下调2,944个，FDR < 0.05），雌性3,285个（上调1,802个，下调1,483个，FDR < 0.05），表明性激素通过这种组蛋白修饰影响染色质结构。

染色体分布分析显示，在雌性中，X染色体上H3K9me3峰的比例显著高于雄性（4.7% vs 0.5%）。此外，雌性中约28%的DB峰（FDR < 0.05）位于X染色体上，而雄性中仅有1.5%的DB峰位于该染色体上。这提示H3K9me3在X染色体失活（XCI）过程中发挥作用。

H3K9me3在启动子、基因体和远端基因间区域的分布分析显示，约20-26%的峰位于启动子区，35-43%位于基因体内，37-38%位于远端基因间区域。值得注意的是，X染色体上的分布模式独特，更大比例的峰位于基因间区域（55-68%），基因体内的代表性较低（16-22%）。这种模式可能反映了X染色体上LINE-1（L1）元件的丰度较高，这些元件富集于基因间区域，并且是H3K9me3介导的沉默的已知靶标。

对位于启动子区和基因体内的DB H3K9me3峰进行通路分析发现，它们显著富集于共同的生物学通路，包括细胞粘附（L1CAM、整合素）、细胞连接、细胞骨架组织（肌动蛋白、Rho GTP酶信号、细胞外基质）、细胞增殖（WNT信号、肝细胞生长因子HGF信号）、胶原生物合成、肝纤维化等组织相关通路；代谢相关通路如cAMP（环磷酸腺苷）介导的信号传导、G蛋白偶联受体信号传导和昼夜节律信号传导；外源物信号传导；雌激素和雄激素信号传导。此外，还发现了一些性别特异性富集的通路。

母体肥胖对H3K9me3特征的影响

与对照母鼠相比，3周龄MO雄性和雌性子代分别出现443和296个DB峰（p < 0.001），表明饮食影响H3K9me3结合。这些DB峰主要与转录调控、细胞分化和细胞粘附相关基因有关。转为维持饲料五周后，DB峰数量减少（雄性116个，雌性188个），表明一些异常的H3K9me3结合持续存在，这与基因表达谱的观察结果一致。

产后饮食干预不能完全逆转母体肥胖的影响

尽管在8周龄时，MO子代肝脏甘油三酯和胆固醇酯水平已恢复至正常水平，但脂肪酸组成仍然改变，特别是在甘油三酯中，饱和脂肪酸富集，而以多不饱和脂肪为代价。这表明五周的对照饮食不足以完全逆转发育和生命早期暴露于母体肥胖的影响。此外，组织学观察显示，8周龄时，MO子代肝细胞中脂滴密度仍略高于对照子代。

研究结论与意义

本研究系统阐述了肝脏转录组性别二态性在性成熟期的建立过程，并首次揭示了H3K9me3在这一过程中的关键作用。研究表明，在生命早期，两性肝脏转录组高度相似，而母体肥胖可对两性子代产生类似的广泛转录组干扰。随着性成熟，肝脏通过H3K9me3介导的表观遗传重编程，建立起涉及免疫应答、解毒代谢、脂质分配等多方面的性别特异性基因表达模式。

最重要的发现在于，母体肥胖所诱导的转录组和表观遗传组（H3K9me3）的异常，在子代断奶后接受五周健康饮食干预的情况下，并未能完全恢复正常。这表明发育关键期的不良环境暴露（如母体肥胖）可对肝脏的表观基因组编程产生持久印记，其影响可能持续至成年期，从而增加代谢疾病（如MASLD）的易感性。这种编程效应可能部分解释了为什么在生命早期经历营养应激的个体，即使在成年后采取健康生活方式，其代谢疾病风险仍然较高。

该研究为理解发育源性代谢疾病的性别差异提供了坚实的表观遗传学机制解释，强调了母体营养状况对子代长期健康，特别是肝脏代谢编程的深远影响。研究结果提示，针对生命早期（包括孕期和哺乳期）的营养干预，对于预防成年期代谢性疾病可能具有至关重要的意义。此外，研究揭示的H3K9me3在建立肝脏性别二态性中的作用，为开发性别特异性代谢疾病治疗策略提供了新的靶点和思路。未来的研究需要进一步阐明H3K9me3修饰调控特定基因表达的具体分子机制，以及这些表观遗传改变是否可能通过生殖细胞传递给后代。