CRISPR-Cas12a的协同DNA激活机制用于灵敏且选择性地检测氟尼辛

《ACS Measurement Science Au》：Cooperative Split DNA Activation of CRISPR-Cas12a for Sensitive and Selective Detection of Flunixin

CRISPR-Cas12a荧光检测法、氟尼辛检测、aptamer探针、分体DNA激活、磁珠传感器、灵敏度提升、选择性验证。

　　在现代生物医学和环境监测领域，药物残留的检测一直是重要的研究方向之一。特别是对于广泛应用于兽医治疗的非甾体抗炎药——氟尼辛（Flunixin），其在动物产品中的残留以及对环境的潜在影响引发了广泛关注。因此，开发一种高灵敏度、高选择性的检测方法对于确保食品安全和环境保护具有重要意义。本文提出了一种基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法，通过功能化磁珠携带的双链DNA（dsDNA）和其短的互补单链DNA（ssDNA）杂交探针，结合CRISPR-Cas12a的协同激活机制，实现了对氟尼辛的超灵敏检测。该方法的检测限（LOD）可达到0.35 nM，相较于传统方法具有显著优势。

氟尼辛作为一种重要的兽药，常用于治疗动物的各种疾病，因其高疗效、长作用时间、低剂量需求以及较快的吸收速率而受到青睐。然而，由于其在食品生产动物中的广泛使用，氟尼辛可能残留在动物源性食品中，并对土壤和水源造成污染，包括饮用水。这种残留可能对人类健康带来一定的风险，如胃肠黏膜损伤、肾脏功能障碍、皮肤刺激、头痛以及中枢神经系统的抑制作用。因此，建立一种准确、可靠的检测方法对于有效监控氟尼辛在食品链和环境水样中的含量至关重要。

当前，液相色谱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是检测氟尼辛的主要手段，因其高精度和高灵敏度而被广泛采用。然而，这些技术依赖于昂贵的仪器和专业的操作人员，限制了其在现场或野外环境中的应用。相比之下，免疫分析法，尤其是侧流免疫分析法，因其操作简便、分析速度快、成本低、设备要求少而受到越来越多的关注。然而，抗体分析法在实际应用中也面临诸多挑战，如抗体生产成本高、化学修饰困难以及热稳定性差，这些因素在资源有限或环境条件苛刻的情况下限制了其适用范围。

在过去二十年中，适配子（Aptamers）因其低成本、高稳定性、易于化学修饰以及高特异性与结合亲和力，成为抗体的有力替代品。对于氟尼辛的检测，已有多种适配子被研究用于其高亲和力结合。例如，Alkhamis等人开发了一种基于链置换的杂交信标传感器，通过引入互补DNA竞争者，实现了对氟尼辛的高灵敏度和高选择性检测，其检测限可达10 nM。本文进一步提出了基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法，利用适配子与杂交探针形成的双链DNA结构，结合CRISPR-Cas12a的协同激活机制，从而提高了检测的灵敏度和选择性。

CRISPR-Cas系统源于细菌和古菌的适应性免疫系统，其核心功能是通过引导RNA（crRNA或sgRNA）识别并切割外源遗传物质。这一机制不仅支持其生物防御功能，还推动了基因编辑技术的发展。近年来，CRISPR-Cas系统在生物传感和分子诊断中的应用日益广泛，尤其在检测双链DNA、单链DNA和RNA方面表现出独特优势。此外，CRISPR-Cas12a也被用于检测非核酸类物质，如小分子、蛋白质和金属离子。在这些传感器设计中，通常需要信号转换步骤，如化学反应或DNA辅助策略，以实现目标分析物的检测。

本文提出的方法中，利用功能化磁珠携带的双链DNA结构，其中包含氟尼辛结合适配子和其短的互补单链DNA杂交探针。通过将适配子与杂交探针形成双链DNA，并利用两个分离的单链DNA共同激活CRISPR-Cas12a的转切割活性，实现了对氟尼辛的高效检测。在该设计中，单独的Act-α或Act-β无法激活Cas12a，因此在没有氟尼辛的情况下，报告DNA保持完整，淬灭剂抑制荧光信号，导致背景荧光较低。而在存在目标分析物时，氟尼辛与适配子结合形成复合物，释放出Act-α，与Act-β共同激活Cas12a，从而引发报告DNA的切割并产生荧光信号。由于释放出的Act-α浓度与氟尼辛浓度成正比，因此可以通过测量荧光强度对氟尼辛进行定量分析。

为了进一步验证该方法的性能，研究人员对四种不同的功能化磁珠（MB-FX1-Act1、MB-FX1-Act2、MB-FX2-Act3和MB-FX2-Act4）进行了测试，其中MB-FX1-Act1表现出最高的信号与噪声比（S/N ratio）。因此，FX1和Act1被选为最优的适配子和全长度激活探针。在优化过程中，研究了适配子和激活探针的浓度以及它们的摩尔比对传感器性能的影响。结果表明，在适配子与激活探针的摩尔比为1:1的情况下，传感器的灵敏度和选择性最佳。

为了进一步提高检测的灵敏度，研究人员采用了更短的单链DNA作为杂交探针，即Act-α，其长度为9个碱基。与全长度激活探针相比，这种较短的DNA探针更容易在氟尼辛存在时从适配子上解离，从而提高传感器的灵敏度。通过实验验证，Act-α释放的量显著高于全长度激活探针Act1，表明该方法在灵敏度上具有明显优势。此外，研究还发现，虽然Act-α与Act-β的激活效率略低于全长度激活探针，但其信号与噪声比更高，因此整体传感器灵敏度得到了提升。

为了评估该传感器在实际环境中的应用潜力，研究人员制备了三种类型的模拟水样，分别将氟尼辛标准溶液（最终浓度为10至50 nM）加入瓶装水、自来水和湖泊水样品中。这些样品在无需预处理的情况下直接分析，结果显示氟ニ辛的回收率在97.9%至108.9%之间，表明环境水样中的基质成分对传感器性能影响不大。此外，传感器的稳定性也得到了验证，即使在4°C下储存15天，其荧光强度与新鲜制备的传感器相比几乎没有明显变化，说明该方法具有良好的稳定性和实用性。

综上所述，本文提出的基于CRISPR-Cas12a的荧光检测方法，通过适配子与互补单链DNA形成的双链结构，结合CRISPR-Cas12a的协同激活机制，实现了对氟尼辛的高灵敏度和高选择性检测。该方法相较于传统的全长度激活探针具有更低的背景噪声，从而显著提高了检测限。此外，该方法还展示了良好的环境适应性和稳定性，能够在多种实际水样中有效检测氟尼辛。这一传感策略不仅为氟尼辛的检测提供了新的思路，也为开发适用于其他非核酸类物质的CRISPR传感器提供了重要的参考价值。