利用基因组编辑花青素标记优化番茄单倍体育种策略的可视化选择系统

《Plant Communications》：An optimized haploid breeding strategy using genome-edited anthocyanin markers for visual selection in tomato

本研究针对番茄单倍体育种中诱导率低和单倍体鉴定困难的技术瓶颈，开发了一种花青素标记辅助策略。研究人员通过CRISPR/Cas9介导的染色体倒位创制了绿色下胚轴雄性不育系GHMS-Inv，实现了高效诱导率评估；同时利用35S:SlAN2-like转基因构建了紫色单倍体诱导系PHI，建立了高精度可视化鉴定体系。该研究为番茄DH育种提供了创新性技术平台，显著加速了育种进程。

　　

在作物育种领域，单倍体育种技术通过快速获得纯合自交系，能够大幅缩短育种年限。然而在番茄等双子叶植物中，单倍体诱导率普遍偏低，且缺乏高效的诱导系筛选和单倍体鉴定方法，这成为制约该技术广泛应用的关键瓶颈。传统鉴定方法需要复杂的分子检测或流式细胞术，耗时耗力且成本高昂，难以满足大规模育种需求。

为解决这些技术难题，中国农业科研团队在《Plant Communications》发表了创新性研究成果。研究人员巧妙利用花青素这一天然色素标记，建立了完整的可视化选择系统。该研究通过基因编辑和遗传工程技术，创制了两个核心材料：一是通过染色体倒位技术获得绿色下胚轴与雄性不育完全连锁的GHMS-Inv评价系，二是通过花青素生物合成关键基因过表达获得的PHI诱导系。

研究采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过设计特异性sgRNA靶向GSTAA（花青素合成）和MS10（雄性育性）基因外显子，在番茄自交系TB0993中成功诱导染色体结构变异。利用junction-PCR（连接点PCR）和遗传分析验证变异类型，从89个T₀代植株中筛选出稳定的倒位系和缺失系。同时，通过农杆菌介导的遗传转化将35S:SlAN2-like表达框导入Sldmp单倍体诱导系背景，经多代选育获得纯合转基因株系。研究还采用竞争性等位基因特异性PCR（KASP）和流式细胞术进行基因分型和倍性鉴定，确保结果准确性。

Generation of GHMS-Inv via CRISPR/Cas9

研究人员成功创制了GHMS-Inv（倒位系）和GHMS-Del（缺失系）两种材料。基因型分析显示，GHMS-Inv通过CRISPR/Cas9介导的染色体倒位实现了GSTAA和MS10基因的完全连锁，而GHMS-Del则存在大片段缺失。表型观察发现，GHMS-Inv表现出绿色下胚轴和完全雄性不育的预期性状，且无不良农艺性状；而GHMS-Del则出现严重生长缺陷。遗传稳定性分析表明，GHMS-Inv×TB0993的BC₁F₁群体在572个后代中未发现重组个体，证明目标性状完全连锁。

Application of GHMS-Inv for HIR assessment

以GHMS-Inv为母本与Sldmp诱导系杂交，在发芽后3天即可根据下胚轴颜色区分单倍体（绿色）和二倍体（紫色）。通过KASP和流式细胞术验证，视觉鉴定准确率达到100%。比较实验显示，GHMS-Inv与TB0993的诱导率相当，证明GHMS-Inv可作为理想的诱导率评价材料。进一步利用GHMS-Inv评价不同遗传背景的Sldmp/F₃植株，发现诱导率存在变异，表明遗传背景影响单倍体诱导效率。

Generation of PHI through transgenic technology

将35S:SlAN2-like构建体转入Sldmp背景，获得13个纯合转基因株系（命名为PHI）。这些株系表现出强烈的花青素着色，但生长和生殖性能正常。花粉活力检测显示，花青素过积累不影响花粉育性，这对母本单倍体诱导系至关重要。多代观察表明PHI性状稳定遗传。

Application of PHI for HID

以雄性不育系ms10为母本与PHI杂交，在种子发育阶段即可根据胚胎颜色（紫色/白色）初步区分倍性。发芽期下胚轴和胚根的色素沉着差异可在明暗条件下清晰区分单倍体与二倍体。幼苗期子叶、茎和真叶的花青素着色进一步强化了分类准确性。基因分型和流式细胞术确认视觉鉴定结果可靠。跨遗传背景验证实验表明，PHI与两个F₁杂交种杂交后，能准确鉴定出单倍体个体。

该研究首次在番茄中实现了基于花青素标记的可视化单倍体育种系统。GHMS-Inv通过染色体倒位技术成功解决了性状连锁不紧密的难题，为高效筛选高诱导率材料提供了可靠平台。PHI诱导系通过花青素生物合成关键基因的调控，建立了从种子到幼苗的全生育期可视化鉴定体系，大幅提高了单倍体鉴定效率。值得注意的是，PHI的创制涉及转基因技术，在具有严格转基因生物监管的国家可能面临生物安全问题。未来探索利用野生番茄天然等位变异实现花青素积累的非转基因途径，将有助于该技术的推广应用。这项研究为番茄单倍体育种提供了创新性解决方案，对加速番茄遗传改良进程具有重要意义。