释放大蒜副产物蛋白的潜力：利用超声波诱导其结构变化，并制备一种针对内皮功能障碍的ACE抑制肽

《Ultrasonics Sonochemistry》：Unlocking the potential of garlic by-product protein: Ultrasound-induced structural modification and fabrication of an ACE inhibitory peptide targeting endothelial dysfunction

超声波预处理通过破坏蛋白质间作用力，改变大蒜副产物蛋白质构象，显著提升酶解效率（500 W时达42.57%），并成功制备ACE抑制肽HDCF（IC50=4.5 μM）。HDCF通过抑制ROS生成（51.53%）、激活Keap1/Nrf2通路（Nrf2核转位增强26.09%）、降低炎症因子（TNF-α/IL-6减少36.6-41.9%）及NF-κB信号（p65磷酸化减少31.33%），有效改善Ang II诱导的内皮功能障碍（凋亡率降低49.75%）和氧化应激（MDA减少38.7%），为功能性食品开发提供新策略。

　　本研究聚焦于利用超声波预处理技术改良大蒜副产物蛋白，并探索其在生产血管紧张素I转化酶（ACE）抑制肽方面的潜力。ACE抑制肽具有保护血管内皮功能的作用，因此，研究其从大蒜蛋白中提取的可行性对于开发功能性食品或营养补充剂具有重要意义。研究结果表明，超声波处理能够破坏蛋白质分子间的相互作用，诱导蛋白质变性，从而减少α-螺旋结构含量，降低颗粒尺寸和ζ电位，同时增强酶解产物的ACE抑制活性。通过优化超声波辅助酶解条件（500 W），成功制备出具有ACE抑制活性的HDCF肽，并通过传统的分离纯化鉴定流程验证了其可量产性，证明了超声波预处理在提高酶解效率和活性肽产量方面的显著作用。

在细胞层面，HDCF被发现能够有效缓解血管紧张素II（Ang II）引起的内皮细胞氧化损伤。具体而言，HDCF通过抑制细胞内活性氧（ROS）的产生，调节氧化相关酶的表达，以及激活Keap1/Nrf2信号通路，从而增强细胞的抗氧化能力。此外，HDCF还通过平衡促炎与抗炎细胞因子，降低细胞粘附分子的表达，以及抑制NF-κB信号通路的激活，有效缓解Ang II引发的炎症反应。进一步的研究显示，HDCF能够通过下调ASK1介导的线粒体凋亡通路，减少内皮细胞的凋亡，从而改善内皮功能。这些发现不仅揭示了超声波处理对大蒜蛋白质结构的深远影响，还为大蒜副产物的可持续利用提供了新的策略，同时也加深了对这种来源于大蒜的ACE抑制肽在改善内皮功能方面的理解。

研究团队通过一系列实验手段，系统地评估了超声波处理对大蒜蛋白质结构的影响。首先，利用SDS-PAGE和HPGPC-RID分析，研究了不同超声波功率（100, 300, 500, 700, 或900 W）对蛋白质分子量分布的影响。结果表明，尽管超声波处理并未显著改变蛋白质的主链结构或亚基组成，但对高分子量（如约52 kDa）成分的相对含量略有减少，同时低分子量成分（如约25 kDa）的含量有所增加。这种变化提示，超声波处理可能通过破坏分子间相互作用，部分展开蛋白质聚集体，从而提高其酶解的可及性。进一步的紫外-可见光谱（UV-Vis）分析显示，随着超声波功率的增加，蛋白质的吸收强度在202 nm处呈现双相趋势：先降低后升高。这表明，在较低强度的超声波作用下，蛋白质的有序肽键结构被破坏，部分转化为无规卷曲结构，从而减少了电子跃迁效率。而在高强度超声波作用下，结构的进一步破坏导致肽键暴露于水分子中，从而改变了电子跃迁特性并增加了吸收强度。类似的变化也出现在280 nm的吸收峰上，提示蛋白质的局部结构被展开，部分芳香族残基（如色氨酸和酪氨酸）被重新定位到更疏水的微环境中，从而降低了它们的吸收强度。然而，当超声波功率达到较高水平时，蛋白质的展开或解聚可能暴露芳香族残基，甚至生成高吸收强度的片段，进一步说明超声波处理对蛋白质结构具有双重影响。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析进一步揭示了超声波处理对蛋白质二级结构的影响。结果显示，随着超声波功率的增加，α-螺旋含量从22.63%下降至10.49%，而无规卷曲含量则从13.69%上升至26.23%。这表明，超声波处理有效破坏了蛋白质的α-螺旋结构，促使其部分展开。在更高功率（500–900 W）下，蛋白质的α-螺旋含量略有回升，无规卷曲含量则相应减少，这可能与局部高温和压力导致蛋白质重新聚集或部分α-螺旋的恢复有关。这些结构变化为后续酶解提供了更有利的条件，从而提高了ACE抑制肽的产量和活性。

在蛋白质的微观结构分析方面，扫描电子显微镜（SEM）显示，超声波处理显著改变了蛋白质的形态。未经处理的大蒜蛋白质呈现出光滑的表面和广泛的聚集现象，而经过超声波处理后，蛋白质颗粒变得更为细小且均匀，表面出现类似凹槽的结构。这些变化归因于超声波产生的空化效应、机械剪切力和局部加热，这些作用破坏了蛋白质的亚基间连接，促进了其分解为较小的分子。同时，部分展开的蛋白质暴露了更多的疏水或带电基团，增强了静电排斥和立体阻碍，从而防止了重新聚集。然而，当超声波功率进一步升高时，蛋白质的二级和三级结构被更彻底地破坏，导致内部疏水区域的暴露，从而促进了蛋白质的重新聚集，增加了颗粒尺寸。这种现象表明，超声波处理对蛋白质的结构影响具有一定的阈值，超声波强度过高反而可能降低其可溶性和酶解效率。

蛋白质的可溶性与结构变化密切相关。研究发现，随着超声波功率从0逐渐增加到500 W，大蒜蛋白质的可溶性持续上升，分别提高了20.90%和26.94%。这可能是因为适度的超声波处理部分展开蛋白质，暴露了更多的亲水基团，从而增强了水与蛋白质的相互作用。然而，当超声波功率超过500 W时，蛋白质的可溶性开始下降，特别是在900 W处理下，可溶性比500 W处理时减少了8.08%。这可能是由于过度的超声波处理导致蛋白质过度变性，疏水区域的聚集以及结构的崩溃，最终形成不可溶的聚集体。这些结果表明，超声波处理对蛋白质可溶性的影响具有一定的限度，需要在适当的强度范围内进行以达到最佳效果。

在酶解和ACE抑制活性方面，研究发现，随着超声波功率的增加，大蒜蛋白质的酶解程度显著提高。在100 W到500 W的处理范围内，酶解程度分别增加了10.08%、30.54%和42.57%。这说明，超声波处理能够有效促进酶解反应，提高ACE抑制肽的产量。然而，当超声波功率进一步增加至900 W时，酶解程度反而有所下降，分别减少了25.21%和8.08%。这可能与过度的超声波处理导致蛋白质结构的破坏，影响酶与底物的结合效率有关。此外，超声波处理还显著提高了酶解产物的ACE抑制活性。在500 W处理后，ACE抑制率达到了88.33%，比对照组提高了85.82%。这一结果表明，超声波处理能够通过改变蛋白质结构，提高酶解效率和ACE抑制肽的活性。

进一步的分离和鉴定工作揭示了HDCF肽的结构和生物活性。通过超滤、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）的联合应用，研究人员成功从酶解产物中分离出具有高ACE抑制活性的HDCF肽。质谱分析（LC-MS/MS）结果显示，HDCF在酶解产物中具有较高的丰度和显著的ACE抑制活性，其IC50值为4.5 μM。这表明，HDCF是通过实际酶解-分离-鉴定流程从大蒜蛋白质中有效提取的。此外，研究还发现，超声波预处理显著提高了HDCF在酶解产物中的相对丰度，进一步支持了其在提高ACE抑制活性方面的关键作用。

在细胞实验中，HDCF被证实具有显著的抗氧化作用。通过DCFH-DA荧光探针检测，HDCF能够有效抑制Ang II诱导的细胞内ROS生成，将ROS荧光强度降低了51.53%。同时，HDCF还能恢复谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，显著降低了丙二醛（MDA）含量，表明其具有良好的抗氧化能力。这些结果提示，HDCF能够通过激活内在抗氧化防御系统，减少脂质过氧化，从而保护内皮细胞免受氧化损伤。

此外，HDCF还被发现能够调节Keap1/Nrf2信号通路，从而增强细胞的抗氧化能力。分子对接实验显示，HDCF与Keap1形成稳定的结合，其结合能和相互作用能分别为96.3847 kcal/mol和73.0868 kcal/mol。这种结合可能通过竞争性抑制Keap1与Nrf2的相互作用，促进Nrf2的核转位，从而激活Nrf2/ARE通路，上调抗氧化蛋白如血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H-醌氧化还原酶的表达。Western blotting分析进一步验证了HDCF对Keap1和Nrf2表达的影响，显示其能够显著降低Keap1的表达并恢复Nrf2的水平，从而促进抗氧化反应的进行。

在抗炎方面，HDCF被证实能够有效缓解Ang II引起的炎症反应。通过检测促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）和抗炎细胞因子（如IL-10）的表达，研究发现，HDCF能够显著降低促炎因子的水平，同时提高IL-10的表达，从而平衡细胞因子的分泌。此外，HDCF还能减少血管细胞粘附分子（VCAM-1和ICAM-1）的表达，进一步抑制炎症反应。这些结果表明，HDCF不仅能够通过调节Keap1/Nrf2通路减少氧化应激，还能通过调控NF-κB信号通路的激活，减轻Ang II引起的炎症反应。

在细胞凋亡方面，HDCF被发现能够显著降低Ang II诱导的内皮细胞凋亡。通过流式细胞术和TUNEL染色分析，研究人员发现，HDCF能够显著减少早期和晚期凋亡细胞的比例，从而降低整体凋亡率。Western blotting分析显示，HDCF能够下调ASK1介导的线粒体凋亡通路中相关蛋白（如ASK1、caspase 9和cleaved caspase 3）的表达，同时上调Bcl-2/Bax比值，从而抑制凋亡的发生。这些结果表明，HDCF能够通过调节线粒体凋亡通路，减少内皮细胞的凋亡，进而改善内皮功能。

综上所述，本研究通过超声波预处理技术，成功改良了大蒜副产物蛋白的结构，提高了其酶解效率和ACE抑制肽的产量。HDCF肽在细胞实验中表现出显著的抗氧化、抗炎和抗凋亡活性，能够有效缓解Ang II引起的内皮功能障碍。这些发现不仅为大蒜蛋白质的高值化利用提供了新的思路，也为功能性食品和营养补充剂的开发奠定了基础。未来的研究将进一步探讨超声波处理如何提升大蒜蛋白质的其他功能特性，如乳化性、起泡性和凝胶化能力，同时系统分析其在酶解过程中生成的多种生物活性肽的性质，包括抗氧化、抗炎和免疫调节等作用。此外，研究还将致力于将这些发现转化为实际的食品配料和营养补充剂，以满足健康食品市场的需求。